经结构修饰的Pluronic P123 在药物递送中的应用
Application of Modified Pluronic P123 for Drug Delivery
赵丽艳，杨艳梅，寇 娜，张万明*
(河北北方学院药学系，河北张家口 075000)
摘要：Pluronic P123 (P123) 是泊洛沙姆类聚合物中的一种，具有增加水难溶性药物的溶解度、延长体内循环时间、增加药物的细胞内摄取、抑制肿瘤的迁移、逆转多药耐药和增强药物的疗效等作用，在递送药物方面具有众多优势。通过对P123 末端羟基的结构修饰，P123 能以酯键、酰胺键和糖苷键等化学键与其他物质结合而生成新的材料，用以制备Pluronic P123- 药物结合物胶束体系、配体介导的主动靶向转运系统及其他药物递送系统，增加药物或基因向靶组织的递送。本文综述了结构修饰后的P123 在药物递送方面的应用。
关键词：Pluronic P123；结构修饰；药物递送；Pluronic P123- 药物结合物；主动靶向；综述
Pluronic P123(P123) 是泊洛沙姆类的一种非离子性表面活性剂聚合物，由亲水段- 疏水段- 亲水段[ 聚氧乙烯- 聚氧丙烯- 聚氧乙烯，PEO-PPOPEO]三嵌段组成。Pluronic 以单体形式溶解，但超过临界胶束浓度(CMC) 和临界胶束温度(CMT)时，可以自行聚集、自组装形成胶束。聚合物中PEO 的长度影响粒子的循环时间和被网状内皮系统吞噬的速度：长链PEO 可延长循环时间，增加粒
子的稳定性，降低网状内皮细胞的吞噬速度。PPO形成胶束的疏水性内核，作为水难溶物质的储库，增加水难溶性药物的溶解度、延长半衰期及增大AUC[ 1—2]。但有报道称P123 聚合物胶束稳定性较差，为了增加胶束的稳定性，可将P123 与其他材料[3—6]，如Pluronic F127、Pluronic L121、Pluronic F68、D-α- 生育酚琥珀酸酯聚乙二醇(D-α-tocopheryl polyethylene glycol succinate，TPGS) 等形成混合胶束。另外，P123 还可用于制备乳剂、片剂、凝胶剂、纳米粒等[7—10]，甚至P123 可用作介孔材料的模板[ 11]。泊洛沙姆聚合物已被美国和英国药典列为药剂学辅料[12]，其中泊洛沙姆188 也被中国药典中列为可使用的药剂学辅料。P123 做为泊洛沙姆中的一员也引起学者的关注。
研究显示，P123 还具有一定的药理作用，可有效抑制肿瘤的迁移[ 13]，抑制P- 糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp) 的外排作用，从而增加P-gp 底物在目标细胞内的富集，进而逆转多药耐药(multidrugresistance，MDR)[14]。此外，P123 与Pluronic F127 制备得到的混合胶束，可与紫杉醇(PTX) 协同作用，通过耗竭细胞内ATP 和降低线粒体跨膜电势等途径增加PTX 的摄取量，从而促进耐药细胞的晚期凋亡、增强PTX 在G2/M 期细胞中的捕获能力和细胞毒作用，因而具有一定的逆转肿瘤MDR 的能力[15]。
近年来，对泊洛沙姆末端羟基的研究引起学者的重视，羟基可通过形成酯键、酰胺键及糖苷键等化学键与其他物质结合得到新的多功能材料，进而用来制备各种剂型，用于药物递送。本文就结构修饰后的多功能P123 在药物递送方面的应用做出综述。
1 Pluronic P123- 药物结合物转运系统
聚合物和药物通过化学结合制备成聚合物-药物结合物的方法，已成为一种新的药物递送手段[ 16]。聚合物- 药物结合物模型是Ringsdorf 在1975 年提出的[17]，在Ringsdorf 最初的模型里是将药物和水溶性聚合物通过化学键结合到一起，这种制剂制备过程简单，载药量和包封率均高。研究显示，将药物和聚合物用化学键结合到一起，可增加水难溶性药物的溶解度，减少药物的突释，提高制剂在体液中的抗稀释能力，减少药物在健康组织的释放，从而减轻药物的不良反应。另外，泊洛沙姆类中的Pluronic F127、Pluronic F68 及Pluronic P105都有与药物制成结合物的报道，Pluronic F127 与多柔比星(DOX) 通过腙键相连，不仅可增加DOX的溶解度，还能利用腙键的pH 敏感性，达到靶向目的[18—19]。P123 也可与多西他赛(DTX) 通过腙键结合，制得具有pH 敏感性的胶束[20]。目前为止，已有聚合物- 药物结合物进行临床研究的报道，如聚-L- 谷氨酸-PTX 处于Ⅲ期临床[ 21]，聚乙二醇-喜树碱处于Ⅰ期临床[22]。此外，Liu 等采用酯键将P123 和DTX 结合，所得结合物用透析法制成胶束，得到的P123-DTX 结合物胶束粒径为(85.3±1.59)nm，呈球形[23]。体外细胞毒性试验结果显示，在HepG2、MCF-7 和B16 细胞株中，与DTX 注射液相比，P123-DTX 结合物胶束毒性较低。荷B16细胞瘤的昆明种小鼠每周尾静脉给药1 次，3 周后可见P123-DTX 结合物胶束具有较低的不良反应和较好的肿瘤抑制效果。
2 配体- 受体介导的主动靶向转运系统
这是利用在肿瘤细胞表面过度表达、在正常细胞低表达或不表达的受体与配体的结合作用，增加药物主动转运的给药途径。P123 末端具有羟基，羟基可通过酯键、酰胺键等化学键来连接配体，如叶酸、精氨酸- 甘氨酸- 门冬氨酸三肽( arginineglycine-aspartate，RGD)、anti-CD44 等，制得具有主动靶向性的新型材料。配体- 受体介导的主动靶向可提高靶组织的药物浓度，降低药物对非肿瘤细胞的不良反应。
2.1 缺氧诱导因子(HIF-1α) 介导的靶向转运系统
HIF-1α，由HIF-1α 基因编码，在核因子NF-κB 依赖的途径中过量表达。HIF 家族可感受细胞所处环境的氧浓度，氧浓度降低或者缺氧可导致HIF-1α 高表达。肿瘤细胞的快速增殖需要大量营养和氧气的供应，此时就会出现供需不平衡，导致出现缺氧。HIF-1α 基因的过度表达，可使肿瘤细胞在缺氧时存活并增殖。肿瘤细胞这种特定的环境，为主动靶向治疗提供了思路。Song 等将丙烯腈与P123在碱性条件下反应，生成腈类修饰的P123 共聚物，继而在氢氧化钠溶液中150 ℃反应7 h，再经酸化处理后得到羧基修饰的P123 共聚物[24]。用羧基修饰的P123 共聚物制备载PTX 胶束，再与带有NH2的抗体孵育，即得anti-HIF-1α-NMs-PTX 纳米胶束，粒径为( 36.5±4.9) nm。与载PTX 的纳米胶束(PTX-NMs)、空白( 不含PTX) 的纳米胶束和羧基修饰纳米胶束(anti-HIF-1α-NMs) 相比，anti-HIF-1α-NMs-PTX 与HIF-1α 过度表达的胃癌细胞(MGC-803) 孵育时显示了较强的细胞毒性[PTX 的浓度为25、50 和75 ng/ml 时的细胞存活率分别为
( 80±2)％、(76±2)％和(69±1)％ ]，而对HIF-1α 弱表达的HDF 成纤维细胞没有显示明显的细胞毒性[ 24]。制备载CdTe 量子点的P123 纳米胶束(NMs-QDs) 和抗HIF-1α 抗体偶联的P123 纳米胶束(anti-HIF-1α-NMs-QDs)，荧光显微镜观察到anti-HIF-1α-NMs-QDs 能靶向胃癌MGC-803 细胞，而对HIF-1α 弱表达的HDF 成纤维细胞无靶向作用。因此，anti-HIF-1α-NMs 能有效地被HIF-1α 高表达的MGC-803 细胞摄取，继而释放药物，达到靶向治疗目的。
2.2 CD44 受体介导的靶向转运系统
CD44 是一种整合膜蛋白，在多种肿瘤细胞表面过度表达，如非小细胞肺癌细胞(NSCLC) 和耐多柔比星人乳腺癌细胞(MCF-7/ADR) 等。因此制备CD44 靶向的纳米制剂，对CD44 过度表达的肿瘤组织将有较好的治疗作用。Gu 等合成了anti-CD44-P123- 聚丙烯亚胺(polypropylenimine，PPI)，并制备了anti-CD44-P123-PPI/pDNA 纳米复合物，以及P123-PPI/pDNA 纳米复合物[25]。与核酸脂质体2000(Lipofectamine™ 2000) 相比，当与乳腺癌细胞孵育时，P123-PPI/pDNA 纳米复合物和anti-CD44-P123-PPI/pDNA 纳米复合物均具有较低的毒性和较高的转染效率。继而将纳米复合物与MCF-7细胞和MCF-7/ADR 细胞孵育。在MCF-7/ADR 细胞中，anti-CD44-P123-PPI/pDNA 纳米复合物显示了更强的荧光强度，是P123-PPI/pDNA 纳米复合物的1.7 倍。BALB/c 裸鼠模型也证明了anti-CD44-P123-PPI/pDNA-DOX 纳米复合物能抑制肿瘤的生长，比DOX 自身抑制效果更好。
2.3 整合素受体介导的靶向转运系统
αvβ3 整合素受体在肿瘤细胞中高表达，但在正常血管中表达很低或不表达，靶向整合素受体的研究引起学者的重视。研究显示，RGD 肽可特异性偶联整合素受体。因此可制备RGD 为靶向配体的给药系统，期望达到主动靶向给药的效果。分别制备了RGD 肽偶联P123-PEI( 其中PEI 为聚乙烯亚胺)，RGD-NLS 偶联P123-PEI( 其中NLS 为核定位信号肽，序列为Lys-Lys-Lys-Arg-Lys，R11)，RGD-TATNLS偶联P123-PEI( 其中TAT 为穿膜肽，RGDTAT-NLS 简称为R18，序列为RGD-RKKRRQRRRKKKRK)[26]，记作P123-PEI-R4、P123-PEI-R11 和P123-PEI-R18，体外荧光素酶检测基因转染效率的结果证明，与P123-PEI 相比，上述偶联肽的复合物在聚合物与DNA 质量比为5、10、20 和30 时，都具有更高转染效率，特别是P123-PEI-R11；MTT 试验显示偶联肽的复合物的细胞毒性较低，说明RGD肽的存在可促进细胞转染[27]。
2.4 叶酸受体介导的靶向转运系统
叶酸受体(folate receptor，FR) 在很多肿瘤细胞表面都过度表达，FR 分为α、β 和γ 3 种亚型，FR 在正常组织中以β 型为主，但仅在肾、肺和胎盘中出现。在肿瘤组织中，FR 表达明显增加。叶酸(FA) 和FR 可特异性识别，因此FA 介导的靶向制剂被众多学者关注。由于FA 有羧基，Pluronic-PEI 有游离的氨基，二者可通过酰胺键结合，生成FA-PEI-P123 和FA-PEI-F127 共聚物。有学者以PTX 为模型药物，将FA-PEI-P123 和Pluronic L121组成混合胶束[28]。形态学研究表明该混合胶束呈球型，表面光滑。与FA-PEI-P123 制备的胶束相比[ 载药量为(2.02±0.18)％ ]，FA-PEI-P123/L121 混合胶束有较高的载药量[ (2.58±0.24)％ ]，这可能是由于L121 的增溶能力比P123 更强。在昆明种小鼠中的组织分布研究证明，与PTX 注射液(Taxol)相比，FA-PEI-P123/L121 混合胶束增加了肺部靶向(Taxol、PEI-P123/L121 混合胶束和FA-PEI-P123/L121 混合胶束的AUC 分别为5.340 8、9.461 0 和14.460 9 μg·h·g-1)。在另一篇报道中，FA-PEI-F127/P123 混合胶束有较高的通透性，其AUC 是PTX 溶液的3 倍[29]。Li 等先合成P123-PTX，利用P123末端的羟基与FA 的羧基结合成酯键，合成FAP123-PTX 聚合物，再将PTX 用透析的方法载入胶束内部，制备了载PTX 的FA-P123-PTX 胶束 (FAP123-PTX/PTX)，以达到物理包埋和化学结合两种方法给药的目的[30]。将荷B16 肿瘤小鼠分为6 组：FA-P123-PTX/PTX 胶束组、P123-PTX/PTX 胶束组、P123-PTX 胶束组、Taxol 对照组、空白胶束组和生理盐水组。与生理盐水组相比，空白胶束没有抗肿瘤效应(P>0.05)。FA-P123-PTX/PTX 胶束组、P123-PTX/PTX 胶束组、P123-PTX 胶束组和Taxol对照组有明显的肿瘤抑制作用，其中FA-P123-PTX/PTX 胶束组抑制作用最强。空白胶束组小鼠的体质量与生理盐水组相近，说明空白胶束基本无毒副作用。与其他给药组相比，Taxol 组小鼠出现明显的体质量降低，提示不良反应明显(P<0.01)。这些结果都说明FA-P123-PTX/PTX 给药系统可以靶向转运抗肿瘤药物，且有较轻的不良反应。
2.5 去唾液酸糖蛋白受体介导的靶向转运系统
去唾液酸糖蛋白受体( asialoglycoprotein receptors，ASGP-r) 是在肝细胞膜表面表达丰富的一种内吞性受体，存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜上。ASGP-r 能特异性识别半乳糖残基、N- 乙酰半乳糖胺残基的糖链或半乳糖苷，并与之结合，通过肝细胞的吞噬作用，将配体转运至肝细胞内。半乳糖基(galactose，Gal) 可通过特异性识别ASGP-r 而将药物转运至肝癌细胞内。Morgan等通过Koenigs-Knorr 反应合成新的纳米生物材料Gal-P123( 四乙酰氧α- 溴吡喃糖与P123 在碳酸银的催化下生成Gal-P123)，并将此材料制备成载米托蒽醌(mitoxantrone，MX) 的功能性脂质体(mitoxantrone loaded Gal-P123 modified liposome，MX-LPG)，研究该制剂的肝靶向性[31]。结果表明，得到的MX-LPG 脂质体粒径为100 nm，呈球形，药物包封率高达97.3％。制备载细胞膜荧光探针DiR(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindotrica rbocyanine iodide) 的脂质体(DiR-LS)、P123 修饰脂质体(DiR-LP) 以及Gal-P123 修饰脂质体(DiRLPG)，并利用活体动物体内光学成像技术，研究脂质体的生物分布。在建立的肝癌原位移植瘤模型中，分别给予DiR 溶液、DiR-LS、DiR-LP 和DiRLPG，体内光学成像显示DiR-LPG 有明显的靶向效果。为了得到更精确的测定结果，注射药物12 h 后，取出动物的主要器官( 心、肝、脾、肺和肾)，进
行荧光分析。结果显示，DiR-LPG 组肝脏的荧光强度是DiR 溶液、DiR-LS 和DiR-LP 的95、2.1 和1.5倍。这说明LPG 可有效靶向肝脏和肝癌细胞[32]。
3 其他药物递送系统
3.1 pH 敏感的药物递送系统
pH 敏感的给药系统在不同pH 值环境下的响应程度不同，可根据体内胃肠道pH 值的连续变化( 胃内pH 值为2，而结肠的pH 值为8.2) 而实现药物的控制释放，或根据病变部位与机体正常生理状态pH 值的差别而实现靶向给药。肿瘤组织的缺氧和缺营养环境会导致乳酸的产生，pH 值较正常的组织要低。另有报道称溶酶体的pH 值为6.0 ～ 6.5[33]。因此制备在pH 7.4 稳定、在较低pH 值快速释药的pH 敏感的给药系统，可减轻药物的不良反应，增加疗效。聚β- 氨基酯(PAE) 是一种pH 响应型生物可降解质子化合物，它在pH 7.4 时不溶，但在较低的pH 值( 低于6.8) 时溶解[34]。Cai 等用迈克尔加成反应将P123 和PAE 结合，达到pH 响应的目的[35]。将合成的P123-PAE 用薄膜分散法制备载姜黄素(Cur) 的pH 敏感胶束(P123-PAE/Cur)，当pH 值从7.4 降到5.5 时，受PAE 质子化作用的影响，P123-PAE/Cur 的粒径从152.5 nm 减小到122.1 nm，ζ 电位从1.5 mV 增大到9.0 mV。体外释放研究结果显示，pH 7.4 时，24 h 内只有16％的药物释放，144 h 有36％的药物释放；pH 5.5 时，144 h 时有61％的药物释放，释放率的增加证明了P123-PAE/Cur 的pH 敏感性。制备载香豆素-6( 作为荧光探针) 的P123-PAE 胶束进一步测试。体外HepG2 和MCF-7 细胞摄取试验显示，pH 5.5 的肿瘤细胞有较强的荧光物质摄取，提示P123-PAE 胶束在较低的pH 值时可增加药物的摄取。
3.2 结构修饰后P123 基因递送系统
目前，基因转运载体主要分为两种，即病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。病毒基因载体的安全性、免疫原性、潜在致癌致突变性等安全性问题，引起了人们高度重视。常用的非病毒载体主要有质粒、多聚阳离子、阳离子聚合物以及阳离子脂质体等。其中阳离子脂质体是研究较多的一类，如LipofactamineTM 2000 已成为商品化的转染试剂。但这类脂质体因易泄露、体内不稳定等限制了广泛应用。聚合物结合阳离子聚合物作为非病毒载体，已引起了广大学者的重视[13,36—37]。而且，泊洛沙姆共聚物结合阳离子转运质粒DNA 能增加基因的表达。Vinogradov 等将阳离子聚合物PEI 与P123 结合，合成了P123-PEI，用其制备载反义寡核苷酸(ODN) 的P123/P123-PEI(9 ∶ 1) 混合胶束，粒径为230 nm[38]。将异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的ODN 混合胶束与KBv 细胞孵育，结果显示细胞摄取增加。在MDR
的抑制试验中，ODN 及其制剂与KBv 细胞孵育，用罗丹明123( rhodamine 123) 评价P-gp 的功能，结果显示由于ODN 基因的表达，P-gp 的功能受到抑制。Gu 等将P123 与阳离子树状聚合物PPI 结合作为非病毒基因载体，形成的P123-PPI/pDNA 聚合物与LipofactamineTM 2000 相比，在MCF-7/ADR 细胞中有高的转染效率[ 39]。胞吞抑制剂研究显示网格蛋白CME 和陷穴小泡CvME 介导的2 种内吞途径对P123-PPI/pDNA 聚合物的转染起到重要作用。
4 结语
近年来，泊洛沙姆共聚物发展迅速，作为增溶剂、稳定剂、乳化剂等活跃在药剂领域，其末端羟基经修饰后可具有pH 敏感、聚合物- 药物结合物和主动靶向的特性，增加药物的递送，增强治疗效果。但是，修饰后的P123 在体内如何代谢、如何排泄、如何保证新型材料在生理条件下的稳定性、如何确定新型材料的安全性、如何确定新型材料体内的药动学等问题仍需要进一步研究解决。随着药剂学的发展和进步，修饰后的P123 将为药物的递送、肿瘤的治疗做出贡献，在临床上应用更加广泛。
基金项目：河北省中医药管理局(2017212)、河北北方学院基金项目(GZ1405)
作者简介：赵丽艳(1986—)，女，讲师，从事新剂型与新制剂研究。
E-mail：[email protected]
通信联系人：张万明(1965—)，男，教授，从事新剂型与新制剂研究。
Tel：18032322089
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