模式生物斑马鱼在中药药效物质筛选中的应用进展

斑马鱼（ zebrafish ）是一种原产于南亚地区的辐鳍亚纲鲤科热带硬骨鱼，全身布满多条深蓝色纵纹。因成群游动时犹如奔驰在非洲草原的斑马群，故得斑马鱼的美称。此外，人们又称其为蓝条鱼、 花条鱼、印度鱼等。斑马鱼最初被用于监测水中的有毒物质和致畸物 ^[1] 。因其体积小，胚胎透明，易于大规模饲养，繁殖能力强和实验周期短，被广泛作为高通量筛选药物的经典模型 ^[2] 。斑马鱼基因组序列与人类有着 87% 的高度相似性 ^[3] ，作为模式生物的优势很突出，这意味着其实验结果大多数情况下也适用于人体。 1981 年， Streisinger 等 ^[4] 首次将斑马鱼与遗传领域和生物学领域进行联系，并介绍斑马鱼是遗传学、分子生物学和胚胎学有机结合的一种模式生物，此后，斑马鱼成为了一种常用来研究基因和发育的脊椎动物模型，被广泛应用于药物药效与毒性的物质筛选研究 ^[5] 。

与哺乳动物相比，斑马鱼在筛选药物药效方面具有独特的优势。近年来，用模式生物斑马鱼对我国具有多靶点、多途径、多环节作用的传统单味中药、复方药和中成药等药效物质的筛选，已受到医药学界越来越多的重视。作为一种完整的动物模型，斑马鱼可以对中药中发挥作用的有效化学成分进行全方面、深层次地研究，进而实现对中药药效物质进行便捷、快速和高通量的筛选。结合国内外近 5 年文献报道，本文综述了模式生物斑马鱼在中药药效物质筛选方面的最新研究进展，主要从筛选心血管药物、调脂保肝药物、抗肿瘤药物、抗骨质疏松药物、抗炎药物和其他药物 6 个方面的研究进展和独特优势进行归纳总结，以期为模式生物斑马鱼在中药中的应用研究提供新的思路，为研究人员在中药新药研究方面提供借鉴参考。

1 斑马鱼在心血管药物筛选中的应用

斑马鱼的心血管系统是由心房、心室、静脉窦和动脉球串联而成 ^[6] ，其生理功能和解剖结构与哺乳动物类似。幼鱼的心脏发育迅速， 5 hpf （ hours postfertilization ）时心脏前体细胞成型， 22hpf 时心脏开始出现收缩动作， 48hpf 时功能性瓣膜基本完全形成。其胚胎在显微镜下观察是透明的，因此，可在心脏发育过程中进行无创的体内成像，能观察到心室的形成、心脏的收缩、血液的流动和血管的生长。此外，斑马鱼与哺乳动物还具有类似的血管发育过程和相同的基因 ^[7] ，这些基因可以促进血管生成和血管新生，如血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor ， VEGF ）。斑马鱼因其在基因水平上与 70% 带注释的人类基因具有真正的同源性，在蛋白水平上与人类之间的药物结合靶点具有高度的同源性，又因其与人类具有相似的心脏形态、心率和功能，可以通过正向和反向遗传方法结合非侵入性、高分辨率成像和基于表型的筛查 ^[8] ，以及当血管缺失时，仍然能够通过对氧的被动运输而继续存活 7 d ，使得斑马鱼成为近年来筛选心血管药物的一种有价值的脊椎动物模型。

随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，糖尿病、高血压、高脂血症、心血管疾病、肥胖等代谢性疾病的发病率呈逐年递增趋势 ^[9] 。有研究表明 ^[10] ，高血压、糖尿病以及其他心脑血管性疾病的发生与微血管功能的失调和障碍有着十分密切的联系，其中血管内皮细胞功能紊乱和血栓的形成分别是导致微血管功能障碍的始发因素和重要因素。陈维武等 ^[11] 利用普纳替尼、花生四烯酸和辛伐他汀 3 种药物诱导斑马鱼幼鱼制备血管内皮损伤模型、血栓模型和微血管缺失模型，测定心输出量、血流速度、肠下血管面积和节间血管直径等相关指标，探究二十五味珍珠片对斑马鱼微血管功能的改善作用。结果发现，二十五味珍珠片质量浓度为 1 mg/L 时，能促进斑马鱼损伤血管的再生；质量浓度为 27.8 mg/L 时，可显著增加斑马鱼的心输出量和血液流动速度；质量浓度为 100 mg/L 时，可显著增加斑马鱼节间血管直径，保护血管内皮功能，减少血栓的形成。

近年来，随着转基因技术的发展， Chico 等 ^[12] 利用在特定的组织表达特异荧光蛋白的转基因斑马鱼进行实验研究，可直观呈现幼鱼组织器官的生长发育或心血管疾病模型下药物对斑马鱼心血管的改善作用。 Liao 等 ^[13] 利用转基因斑马鱼 Tg （ VEGFR2:GFP ）（血管中表达绿色荧光蛋白）研究新化合物丹参醇冰片酯（ tanshinolborneol ester ， DBZ ）对人内皮细胞增殖、迁移和血管生成的影响。该团队使用酪氨酸激酶抑制剂瓦他拉尼（ vatalanib ， PTK787 ）建立斑马鱼血管损伤模型，通过在荧光显微镜下观察斑马鱼体节间血管（ intersegmental vessel ， ISV ），评价 DBZ 促血管生成的作用。结果表明， DBZ 可以部分恢复 PTK787 诱导的斑马鱼 ISV 的阻断作用，其机制可能是通过激活蛋白激酶 B （ AKT ）和丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）信号通路对损伤的血管产生保护作用， DBZ 促进了血管生成的多个关键步骤，可开发成用于治疗心肌梗死和其他心血管疾病的药物。 斑马鱼在心血管中药筛选中的研究进展见表 1 。

2 斑马鱼在调脂保肝药物筛选中的应用

肝脏代谢相关的疾病已成为严重危害全人类身体健康的主要因素 ^[21] ，且由此引发的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此，对肝脏代谢相关疾病的发病机制研究和对高效、低毒的调脂保肝药物的开发显得尤为重要。斑马鱼作为一种基因组序列与人类有着 87% 的高度相似性的模式生物 ^[22] ，因其血脂构成、脂质吸收、脂质代谢等过程与人类基本一致，近年来被广泛应用在与肝脏代谢相关的疾病研究中，如高脂血症、酒精性脂肪肝、肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌等 ^[23] 。又因其与人类在肝细胞组成、功能、信号和对损伤的反应等方面很相似，且所有的消化器官在幼鱼 120 hpf 时就已完全成熟，可在数天内快速发展成发育缺陷或由毒素 / 乙醇所致的一些肝胆疾病 ^[24] ，使它们成为筛选调脂保肝类药物和研究肝病发病机制的有用系统。近年来，使用斑马鱼研究肝脏病理学的研究者数量正逐渐增长 ^[25] ， 2014 年还建立了斑马鱼疾病模型协会。

非酒精性脂肪肝病（ non-alcoholic fatty liver disease ， NAFLD ）和非酒精性脂肪肝炎（ non-alcoholic steatohepatitis ， NASH ）是世界上最常见的慢性肝病，其发病率高达 25% ^[26] 。有文献报道 ^[27] ， 在未来的 10 年， NAFLD 很可能会超越乙型肝炎成为威胁全球人民健康的新疾病。因此，我国传统的调脂保肝类中药，因具有副作用小、多靶点、多途径和多环节的优点而受到了格外的关注。余琳媛等 ^[28] 使用 2 mg/mL 的蛋黄粉复制斑马鱼非酒精性脂肪肝模型，用于研究传统调脂中药制首乌及其主要成分大黄素对 NAFLD 的治疗作用。预防给药 72 h 后，观察各组存活率、体质量、体长、体质量指数（ body mass index ， BMI ）的变化，用油红 O 染色检测肝脏脂质的沉积，用苏木精 - 伊红染色检测肝组织的病理形态，以及用三酰甘油（ TG ）和总胆固醇试剂盒检测体内脂质含量。结果显示，制首乌醇提取物和大黄素均能显著降低 NAFLD 斑马鱼的死亡率、 BMI 和 TG 水平，可明显改善斑马鱼幼鱼肝脏脂质的沉积，由此推测制首乌治疗 NAFLD 的主要有效成分是大黄素。

Ahmad 等 ^[29] 采用高胆固醇饮食诱导 NAFLD 斑马鱼幼鱼模型，研究传统中药天麻中的主要活性成分天麻素（ gastrodin ， GAS ）的调脂保肝和抗氧化作用。通过对斑马鱼进行尼罗红染色、苏木精 - 伊红染色、 ROS 荧光染料染色、实时荧光定量 PCR （ qRT-PCR ）实验以及对体内脂质水平和活性氧、丙二醛水平进行测定，结果表明， GAS 显著降低 NAFLD 斑马鱼 TG 、总胆固醇、活性氧和丙二醛水平，对 高胆固醇饲料（ highcholesterol diet ， HCD ）诱导的 NAFLD 斑马鱼幼鱼模型具有脂质调节和抗氧化作用，其可能的机制是抑制甾醇调节原件结合蛋白（ SREBP1 ）、脂肪酸合酶（ FANS ）、肿瘤坏死因子 -α （ TNF-α ）、白细胞介素 -6 （ IL-6 ）、 IL-1β 和 TGFB 等基因的表达，提示过氧化物酶体增殖物激活受体 α （ PPARα ）途径和核转录因子红系 2 相关因子 2 （ Nrf2 ）、血红素加氧酶 1 （ HO-1 ）途径可能是 GAS 对脂质调节和抗氧化的作用靶点，揭示 GAS 是一种潜在治疗 NAFLD 的药物。此外，随着人们饮食习惯清淡到油腻的改变，我国的肥胖患者也在逐年递增，肥胖常与其他复杂的疾病共存，如心血管疾病、 2 型糖尿病以及一些癌症 ^[30] 。因此，开发新的抗肥胖药物迫在眉睫。 Costa 等 ^[31] 利用斑马鱼和细胞模型探讨蓝藻菌株治疗肥胖相关并发症的可能，并对其生物活性、毒性以及代谢产物进行了评估分析，其结果表明，蓝藻菌株对代谢性疾病具有巨大的治疗作用。这项研究提示 ^[32-33] ，海洋极可能是新型抗肥胖药物的一个极具前景的来源。斑马鱼在调脂保肝中药筛选中的研究进展见图 1 和表 2 。

3 斑马鱼在抗骨质疏松药物筛选中的应用