Plus深读 | PVT1 lncRNA的启动子序列是肿瘤抑制性的DNA元件

本文发现

1：PVT1启动子沉默会促进乳腺癌细胞增殖

2：PVT1启动子能够抑制MYC的转录

3：PVT1和MYC的启动子的活性相互竞争

1：PVT1 CRISPRi促进细胞增殖

首先研究者证明PVT1 CRISPRi会导致细胞增殖加快，具体说来是针对PVT1的前两个TSSs（TSS1和2）区域的sgRNA（Fig.1A, S1A-C）。这其中，针对TSS1的CRISPRi有着更明显的促进增殖的效果（Fig.1B，S1C-D），因此研究者接下来分析了TSS1处的区域，称为PVT1的启动子。CRISPRi-PVT1的细胞增殖远快于对照的CRISPRi-LacZ细胞，并能够形成更大的克隆、和更多的卫星克隆（Fig.1C-D）。体内成瘤实验同样验证了同样的结果（Fig.1E），以上数据说明PVT1 promoter的敲除呈现出与前人报道相反的结果（PVT1是原癌基因）。

Figure 1

Figure S1

2：PVT1启动子敲除促进MYC表达水平

通过RNA测序，研究者发现PVT1启动子敲除的细胞中MYC水平剧烈上升（Fig.2A）,，MYC蛋白水平也同时升高（Fig.2B）。研究者进一步在PVT1启动子上，即TSS1前后各设计一系列的sgRNAs，发现只有针对TSS1位点后面的sgRNAs才能够抑制PTV1的水平、并提高MYC表达（Fig.2C）。在PVT1 CRISPRi的细胞中再敲低MYC表达，能够抑制其增殖（Fig.2D-E）；并且PVT1和MYC的表达呈现了明显的负相关（Fig.2F），说明PVT1敲除后的过度增殖表型可能是由于其对MYC水平的促进造成的。

Figure 2

3: PVT1 locus对MYC的调控不是由其lncRNA序列本身促进的

接下来研究者分析了PVT1 lncRNA本身对于MYC表达调控是否有影响，有趣的是发现降低其编码序列本身并不会减少MYC的表达（Fig.3A-C）。

Figure 3

4：PVT1上的DNA元件能够抑制MYC转录和表达

通过Hi-ChIP实验发现，MYC和PVT1位于同一个TAD结构上（Fig.4A）。并且MYC水平受到PVT1上的启动子、和内含子上的增强子结构共同调节，具体表现在PVT1的水平能够受到两者的抑制（Fig.4A-C）。作为证据，研究者进一步观察了能够启动转录的BRD4、以及Pol II再MYC和PVT1上的结合，发现CRISPRi-PVT1能够抑制PVT1转录的同时，促进MYC的转录（Fig.4D-F）。

Figure 4

5: PVT1启动子对于MYC转录的调节是可逆的

研究者构建了利用CRISPR技术过表达的CRISPRa-PVT1，发现能够促进PVT1表达的同时抑制MYC（Fig.5A-B），并且抑制BRD4和Pol II在MYC上的结合（Fig.5C-F）。与此同时，CRISPRi-MYC抑制MYC的表达能反过来促进PVT1的表达（Fig.5G），综合以上结果，PVT1和MYC的启动子存在竞争作用（Fig.5H）。

Figure 5

6：PVT1启动子能够调控同一染色体上的MYC表达

在以往的报道中，PVT1 lncRNA的功能主要集中在结合RNA结合蛋白以及其他调控型RNA。研究者巧妙的利用129S1和Castaneous小鼠的F1代杂合子分离出单细胞，培养和分化并进行ATAC和ChIP测序分析(Fig.6A)，发现如下：

1）mESC中两个亲本来源的PVT1都会表达(Fig.6B)

2）分化后（mNPC）仅有其中一条染色体上的PVT1表达(Fig.6B)

3）表达PVT1的那条染色体上，MYC的表达受到抑制（Fig.6B-C），并且MYC和PVT1的表达水平呈现负相关(Fig.6D-E)

Figure 6

7：肿瘤病人中存在许多PVT1启动子上的突变

通过分析已有的肿瘤病人测序结果，发现PVT1 locus附近存在大量突变、大片段缺失等，尤其是在其TSS附近（Fig.7A-D）。研究者进一步利用CRISPR编辑附近的序列，发现突变细胞增殖速度更快（Fig.7E），且细胞中的MYC水平更高（Fig.7F）

Figure 7

讨论：

PVT1是首个报道与肿瘤相关的lncRNA，是一个原癌“基因”，并且在肿瘤病人中可见突变。本研究并未局限于lncRNA本身的功能，而是利用其在基因组上与MYC相邻的位置特点，进一步发现了在DNA序列水平上PVT1对MYC表达的直接调节，证明了PVT1序列水平上对于MYC表达的抑制作用、以及肿瘤发生的抑制作用。

文章来源

Seung Woo Cho, et al. (2018). Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell 173, 1-15.

Reference:

1. Dixon, J.R., Selvaraj, S., Yue, F., Kim, A., Li, Y., Shen, Y., Hu, M., Liu, J.S., and Ren, B. (2012). Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376–380.

2. Schmitt, A.M., and Chang, H.Y. (2016). Long noncoding RNAs in cancer pathways. Cancer Cell 29, 452–463.

3. Tseng, Y.Y., Moriarity, B.S., Gong, W., Akiyama, R., Tiwari, A., Kawakami, H., Ronning, P., Reuland, B., Guenther, K., Beadnell, T.C., et al. (2014). PVT1 dependence in cancer with MYC copy-number increase. Nature 512, 82–86.