昨天，我们探讨了浙江大学发表于 14.5 分的 Cell 子刊 Molecular Cell 上的那篇文章。今天，咱们就接着来瞧瞧，这篇文章是如何遭遇质疑，以及面对质疑又是怎样回应的（
所有的质疑应该都符合逻辑，而对各种质疑的回应，也需要通过合理的假设的推断来进行，这就是科研的推进过程，不清楚科研逻辑的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）。首先，来看看人家是怎么质疑这篇文章的：
质疑的内容其实并不复杂，这篇质疑同样发表在 MC 上。质疑者首先对小鼠的骨骼肌和肝脏展开检测。他们先是分析了骨骼肌在休息和收缩状态下（试图借骨骼肌收缩模拟能量胁迫）eEF2 的磷酸化情况，结果显示，缺失 AMPKα 后，并未出现更强烈的 eEF2 磷酸化激活现象（
这里也就是通过柯霍氏法则在进行验证，通过缺失上游分子，或激活上游分子，来查看对于下游会产生什么样的表型或者表达的差异，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）。同时，使用 AMPK 激活剂，也未能成功激活 eEF2 的磷酸化。
该怎么评价这个结果呢？实际上，这个结果所采用的研究模型，与原文的研究模型并非完全一致。骨骼肌收缩所产生的影响，和能量胁迫导致的结果并不全然相同。而且，他们使用的 AMPK 激活剂，是模拟腺苷结合的，效果并不显著，并且这个研究结果并非在 AMPKα 缺失的条件下得出。之前的研究表明，AMPKγ 是通过抑制 eEF2 的去磷酸化来影响其磷酸化结果，而促进 eEF2 的磷酸化则是通过 mTOR 信号通路中的 mTOR1 复合体激活实现的（
mTOR复合体1和mTOR复合体2是mTOR信号通路中的关键，通过激活mTOR复合体，会对下游的包括自噬以及NFκB信号通路等造成影响，如果你还对 mTOR 信号通路不熟悉的话，可前往《信号通路是什么鬼？》系列查阅，里面有详细讲解
）。所以，此处没有观察到磷酸化变化，还真难以确切判断其中缘由。
接着，质疑者的目标是探究在 AMPKα 缺失的情况下，AMPKγ 能否与 AMPKβ 形成复合体，以及该复合体是否能够结合 PPP6C。他们所做的 coIP 实验挺有意思（
coIP图是解释蛋白互作的关键方法，其实也就是通过WB来分析两个蛋白能否结合，并拉下来，如果不懂coIP图的话，可以去翻翻《夏老师带你读文献》，里面介绍过怎么看coIP图
）
，即在 IP 的 WB 完成后，用上清再进行一轮 WB，以此查看未结合的部分是否有对应蛋白表达。结果发现，在 AMPKα 缺失时，AMPKγ 和 AMPKβ 确实能够形成复合体，但其具体功能尚不明确。然而，AMPKγ 和 AMPKβ 形成的复合体，却未能与 PPP6C 结合。
在骨骼肌实验中，他们用 AMPKβ 去结合 PPP6C，同样未能成功。基于此，他们认为可能不存在 AMPKβ/γ 与 PPP6C 的结合。
在骨骼肌、肝脏以及 293T 细胞中，均未检测到 PPP6C 与 AMPKβ/γ 的相互作用。于是，他们得出结论：AMPKγ 并非独立于 AMPKα，且在人类和小鼠的肌肉及肝脏中，不与 PPP6C 发生互作（
说实话，这个结论下得有点仓促。就拿上面这张图来说，浙大那篇文章表明，在能量胁迫环境下，AMPKγ 能与 PPP6C 更好地结合，而这里并未对这一点进行验证，两者论述的命题其实并不兼容，不难看出，这篇质疑文章中的很多内容相对孤立。不清楚这里的科研逻辑的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）
所以，这篇质疑其实挺好反驳的
，下面我们就来看看浙江大学赵斌课题组是如何回应的：
首先，他们重复了质疑文章中的互作实验，即探究骨骼肌和肝脏中是否存在 AMPKβ/γ 与 PPP6C 的结合。同时，他们更换了缓冲液，发现质疑文章所使用的缓冲液存在问题，验证不出结果也在情理之中。
接着，他们指出，在质疑文章中，其实也显示出在 AMPKα 缺失的情况下，eEF2 的磷酸化有所增强。并且，他们采用的 Post - IP 实验，最终也能表明存在 AMPKβ/γ 与 PPP6C 的结合。
此外，他们认为这篇质疑文章仅仅着眼于 PPP6C 与 AMPKβ/γ 的互作，并未深入分析其功能，所以意义不大（对此观点，我个人表示认同）。实际上，这篇文章的关键问题确实在于 PPP6C 与 AMPKγ 的互作，但又不止于此。大家还记得上次讲解这篇文章时提到的，其验证方法存在一定瑕疵吗？在最后验证 PPP6C 与 AMPKγ 互作的过程中，他们利用 AMPKγ 的腺苷结合位点突变，观察 PPP6C 的结合情况，并通过敲减 PPP6C 来查看 eEF2 的磷酸化。（
这种验证方式实际上犯了肯定后件的逻辑谬误，极有可能 PPP6C 能与 AMPKγ 结合，但 AMPKγ 还可能通过其他途径影响 eEF2 的磷酸化。要是对肯定后件逻辑谬误不太清楚，可以看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）
从更严谨的角度来讲，应该在突变 PPP6C 与 AMPKγ 的结合位点后，分析 eEF2 的磷酸化变化。在此处，不能仅仅突变 AMPKγ 上的腺苷结合位点，因为下游验证的是 PPP6C 的功能，所以还应当突变 PPP6C 上结合 AMPKγ 的位点，大致情况如下：
当然，这只是我的个人看法，并不意味着我的观点绝对正确。大家也可以有自己的见解。但如果仅仅通过敲除 PPP6C 来进行验证，相对而言可能不够严谨，存在一定瑕疵。总体而言，浙大这篇文章在思路上非常值得肯定与借鉴。对于质疑文章的回应，也很有底气，算得上是一次出色的回应。好了，今天就先聊到这儿。要是感兴趣，不妨去看看原文，祝愿大家都能在科研探索中保持敏锐，收获满满。
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