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天津工业生物技术研究所等发现甲醛缩合酶formolase活性调控新机制

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2025-03-16 14:20

正文

▲共同第一作者：谭子瑊、唐梓静

共同通讯作者：朱蕾蕾研究员、刘海峰教授

通讯单位：中国科学院天津工业生物技术研究所

论文DOI：10.1021/acscatal.4c07452（点击文末「阅读原文」，直达链接）

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本研究发现了 α21- 螺旋与其邻近螺旋形成的拉链结构能够有效调控低甲醛浓度下的 formolase _BFD 催化活性。进一步通过对 α21- 螺旋的工程化改造，精细优化了底物 / 产物通道形状，获得了 40 mM 甲醛下提升 86.5 的突变体。

背景介绍

近年来，人工设计的甲醛缩合酶 formolase因其催化单一底物甲醛的羟醛缩合反应而备受关注。凭借反应热力学的可行性、原子经济性等诸多优势，formolase已广泛用于多种人工C1化合物转化途径。在与其他酶偶联的多酶系统或细胞工厂中，由于甲醛对酶具有毒性，通常需采用低浓度甲醛进行反应。因此，开发能够在低浓度甲醛条件下表现出更高催化活性的formolase变体成为研究的重点。

本文亮点

本研究发现由 α17-螺旋和α21-螺旋组成的拉链结构通过调控底物通道的大小和形状来调节甲醛缩合酶formolase _BFD 的活性。其中，作为底物通道壁一部分的α21-螺旋，充当 通道调控螺旋 的角色，在拉链结构的开闭状态转换中发挥了重要作用。因此，针对该调控螺旋进行工程化改造，增强了 底物甲醛在活性口袋的富集 ，成功获得了在 低浓度甲醛条件下活性显著提高的 formolase _BFD 变体。

图 1 研究亮点图示

图文解析

α21-螺旋结构运动的识别

本研究首先以 formolase _BFD-M3 为模板通过定向进化重组获得了低甲醛浓度下高活性突变体K1（W463R/S26F/H281Y）。基于图2所示的结构分析，发现三个突变位点均与一个参与底物/产物通道壁构成的α21-螺旋相关。其中，W463R位于α21-螺旋上，并与二聚体中另一单体上的S26F和同单体上的H281Y相邻。考虑到α21-螺旋的C端与一个长而灵活的环连接，可能会赋予α21-螺旋结构运动的能力。我们大胆假设 α21-螺旋可以通过运动调节通道的大小与形状，进而调控底物进入或产物的释放。

图 2 α21- 螺旋与 K1 的突变位点的位置展示。图示的 W463R 、 H281Y 及 α21- 螺旋在一个单体上， S26F 在另一个单体上。

进一步，采用DynDom预测（图3a）和加速分子动力学模拟（图3b）的手段确定了α21-螺旋存在结构运动的现象。

图 3 α21- 螺旋的结构运动分析。 a ） DynDom 基于 11 个 BFD 结构预测 α21- 螺旋的潜在运动。 d ）加速分子动力学模拟中 formolase _BFD-M3 沿第一主成分（ PC1 ）的结构运动。

通过对α21-螺旋的分子改造提升formolase在低底物浓度下的活性

本研究选择 α21-螺旋上的通道朝向的三氨基酸位点M460、W463和L467（图4），以K1为模板进行了多位点饱和突变。通过筛选发现多个突变体在20 mM、300 mM甲醛下的活性高于K1。

图 4 通道朝向的三个氨基酸位点 M460 、 W463 和 V467

如图5所示，突变体 K1 到 K7 在 5 至 180 mM 甲醛浓度范围内的活性显著高于 formolase _BFD-M3 ，尤其是在较低浓度下。具体而言，变体 K1-K7 在 160 mM 甲醛下的活性提高了 7 至 14 倍，在 50 mM 甲醛下的活性则显著提高了 28 至 57 倍。最佳变体 K6 在 20 mM 甲醛下的活性比 formolase _BFD-M3 提高了 27.3 倍，在 160 mM 甲醛下提高了 13.9 倍，在 40 mM 甲醛下达到最大倍数提升， 86.5 倍。

图 5 Formolase _BFD-M3 及其突变体的反应动力学测定

Formolase突变体在低甲醛浓度下活性显著提升的分子机制

通过晶体结构解析与分子动力学模拟等手段，确定了最佳突变体 K6能够稳定底物通道的底部区域，避免了活性中心的暴露，并通过α21-螺旋构象变化使打开了底物通道的入口，从而使甲醛更容易进入通道并到达活性中心。

图 6 Formolase _BFD-M3 和变体 K6 （ M3-S26F/H281Y/W463Q/V467L

天津工业生物技术研究所等发现甲醛缩合酶formolase活性调控新机制

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