上期介绍了10种研究蛋白-蛋白互作的常见方法，今天介绍几种研究小分子药物和蛋白互作的一些方法：表面等离子共振技术（SPR）、药物亲和反应靶向稳定性DARTS、细胞热迁移技术（CETSA）、小分子-蛋白质Pull-down技术、等温量热滴定（ITC）、微量热泳动技术（MST）和荧光偏振免疫分析法（FPIA）。
常用指数—☆☆☆☆☆，既可以用于筛选，也可用于验证，表面等离子共振( Surface Plasmon Resonance，简称SPR)是一种基于光学原理的分析技术，它能够实时监测生物分子之间的相互作用。SPR技术的原理是在金属表面上发生全反射时，形成消逝波进入光疏介质中，与介质中的等离子波相遇时可能发生共振现象。这种共振导致反射光强度的降低，通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。
1.芯片准备：首先需要安装传感器芯片，这通常是一个镀有金膜的玻璃芯片。在实验开始前，需要用适当的缓冲液冲洗芯片，以确保信号基线的稳定性。2.芯片激活：通过使用EDC/NHS等化学试剂处理芯片表面，使其活化，以便生物分子能够共价结合到芯片上。3.配体偶联：将配体小分子药物偶联到活化的芯片表面。偶联可以通过直接共价结合或通过某种特定的相互作用（如His标签与NTA芯片的结合）来实现。4.稳定基线：在配体偶联后，需要观察并稳定基线，确保在分析物注入前，信号是稳定的。5.分析物注入：将含有分析物（蛋白质、核酸、小分子或细胞裂解液）的溶液以恒定流速注入芯片表面。6.实时监测：SPR仪器的光学系统会实时监测分析物与配体结合和解离的过程。这些信息会被转换成传感器图，从而可以分析分子间的结合动力学和亲和力。7.数据分析：通过分析软件处理传感器图，可以得到分子间的结合常数Ka、解离常数Kd或亲和力常数KD等关键参数。常用指数—☆☆☆☆☆，既可以用于筛选，也可用于验证，药物亲和反应靶向稳定性（Drug Affinity Responsive Target Stability，简称DARTS）技术是一种用于小分子药物靶点筛选和鉴定的方法。原理是当小分子药物与其靶标蛋白结合后，会使得靶标蛋白对蛋白酶的降解敏感性下降，从而变得更稳定。
1.样品准备：首先从细胞或组织中提取蛋白质样品，为实验提供必要的原料。2.药物孵育：将小分子药物与靶细胞蛋白样品共孵育一定时间，以促进药物与潜在靶点蛋白的结合。3.蛋白酶处理：在孵育后，加入蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶或链霉菌蛋白酶）进行水解消化。这一步是为了模拟体内的降解过程，并观察药物是否存在保护作用。4.凝胶电泳分析：通过SDS-PAGE等技术进行凝胶电泳分析，比较有无药物存在的情况下，蛋白质被蛋白酶切碎的程度。这一步可以帮助研究者观察到药物对靶蛋白稳定性的影响。5.数据分析：最后，通过对比分析有药物和无药物条件下的蛋白质条带变化，确定药物是否与靶点蛋白结合。这一步骤是确认药物作用机制的关键。细胞热迁移技术（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是一种用于检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验技术。当靶蛋白与药物分子结合时，通常会变得更稳定。随着温度的升高，蛋白会发生降解；而当蛋白结合药物后，在相同温度下，未降解蛋白的量会提高，这导致该复合蛋白的热熔曲线右移。
注：CETSA实验的样品来源可以是细胞，也可以是组织样本。检测方法主要有Western blot-验证和质谱（MS）-筛选。
1.首先将构建好的质粒瞬时转染到HEK 293T细胞中，并进行细胞转染，待转染完成后，将细胞暴露于特定药物中持续一定时间，以便药物与可能的靶点蛋白发生作用。2.随后，收集这些细胞，并使用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液进行洗涤，以防止蛋白降解。洗涤后的细胞经过培养计数，再用PBS重悬至所需的最终密度。3.接下来，将细胞分装到PCR管中，并在热循环器中设定特定温度进行加热，促使蛋白质变性。变性后，将细胞重悬于含有NP40的缓冲液中，并进行液氮冻融循环以裂解细胞。裂解后，通过离心收集上清液，此时上清液中含有细胞裂解后的蛋白质。4.最后，向收集的上清液中加入SDS loading buffer，并进行沸水浴以灭活蛋白质，为Western blotting实验做准备。Western blotting用于检测特定蛋白的表达和药物处理的效果。如果需要进一步的蛋白质鉴定，可将Western blotting后的凝胶进行切割，并将切下的蛋白条进行质谱分析，以确定蛋白和药物作用的靶点。
小分子-蛋白质Pull-down技术（Small Molecule-Protein Pull-down assay）。通过将小分子化合物进行化学修饰，如添加生物素（Biotin）标签，然后利用亲和层析的方法从细胞或组织中提取的蛋白质中捕获与小分子结合的蛋白，并通过质谱技术鉴定和筛选小分子的特异性结合蛋白。
1.小分子的化学修饰：首先，对小分子化合物进行生物素或其他标签的化学修饰。不同的小分子化合物结构不同，标记修饰策略和难度也各不相同。结构简单的小分子可以直接进行反应，而结构复杂的可能需要进行衍生化后修饰。2.细胞裂解蛋白提取：将细胞裂解，提取总蛋白或特定亚细胞器蛋白，如核蛋白、线粒体蛋白等。3.孵育：将标记修饰后的小分子与蛋白裂解液充分孵育，允许小分子与其潜在的靶点蛋白结合。同时，使用非标记的等量的小分子化合物和游离的生物素分子作为对照组平行试验。4.亲和纯化：使用链霉亲和素（Streptavidin SA）的磁珠或其他亲和介质，特异性地捕获生物素标记的小分子及其结合的蛋白。通过洗涤去除未结合的蛋白质，富集小分子-蛋白复合物。5.SDS-PAGE电泳分析：将洗脱的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，使用银染或Western blot等方法进行检测，以分析蛋白的差异情况。6.质谱分析：将洗脱的蛋白样品进行胰蛋白酶消化成肽段，然后利用液质联用技术(LC-MS/MS)进行分析，结合数据库检索，可以鉴定与小分子结合的潜在靶标蛋白列表。等温量热滴定仪（Isothermal Titration Calorimetry，简称ITC）通过测量反应体系温度的变化来研究分子间的相互作用。它可以直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量，适用于研究蛋白、核酸、多肽、药物分子等的相互作用。
1. 样品准备：确保样品浓度和体积适宜，澄清无颗粒，并通过离心或微滤处理去除气泡。2. 样品的前处理：进行缓冲液交换和脱盐，使用透析、凝胶过滤、超滤等方法。3. 仪器准备：打开ITC仪器和控制软件，清洗样品池和滴定针。4. 设定参数：设置实验温度、参考功率、搅拌速度、初始延迟时间和滴定参数。5. 加样：将样品加入样品池，将滴定液加入滴定针，并确保无气泡。6. 开始实验：输入样品浓度，确认实验参数后开始实验，监测热量变化。7. 数据分析：实验完成后，软件自动或手动进行数据积分和拟合分析，得到亲和力、反应热等热力学参数。微量热泳动技术（Micro Scale Thermophoresis，MST）基于检测在温度梯度中的生物分子电泳迁移率的变化，从而分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。
1. 样品准备：首先，需要纯化目标蛋白，并使用荧光染料（如NHS-647）对其进行标记。标记后的蛋白通过色谱柱纯化以去除未反应的染料，并准备一系列不同浓度的小分子药物溶液用于后续实验。2. 样品标记与孵育：将荧光标记的蛋白与小分子药物混合，并在室温下孵育一定时间，以允许药物与蛋白充分结合。3. 亲和力测试：使用MST仪器，将混合样品装入毛细管中，通过红外激光产生局部温度梯度，观察荧光标记的蛋白分子在温度梯度下的热泳动变化，并记录荧光强度的变化。4. 数据分析：利用MST仪器记录的荧光强度变化数据，通过软件进行数据拟合和亲和力常数的计算，从而得出药物与蛋白之间的结合亲和力（Kd值）。5. 实验条件优化：根据初步实验结果，可能需要调整样品浓度、孵育时间和温度等条件，以优化实验条件并获得更准确的实验数据。荧光偏振免疫分析法（Fluorescence Polarization Immunoassay，FPIA）是一种基于荧光偏振原理的定量免疫分析技术，用于研究生物分子间的相互作用。FPIA技术的核心在于，荧光物质在受到单一平面的偏振光照射后，会吸收光能跃入激发态，然后返回到基态，并发出偏振荧光。偏振荧光的强度与荧光分子的大小成正比，与其在激发时的转动速度成反比。
1.样品准备：首先，针对目标蛋白选择合适的阳性药物，并对其进行荧光标记。这些药物通常是小分子，可以通过荧光素（如FITC）进行标记。
2.配制标准抗原：配制一系列不同浓度的标准抗原，这些抗原是已知剂量的非标记抗原，通常由试剂盒提供。
3.竞争结合反应：将一系列已知浓度的标准抗原与一定量的标记抗原在一定条件下与限量的特异性抗体进行反应。在反应过程中，未标记的抗原和标记的抗原会竞争性地与抗体结合。
4.荧光偏振测量：反应达到平衡后，使用荧光偏振免疫分析仪器测量反应体系的荧光偏振程度。荧光偏振的程度与荧光分子的大小成正比，与其在激发时的转动速度成反比。
5.数据分析：通过测定一系列已知浓度的标准抗原所对应的荧光偏振程度，绘制竞争结合抑制标准曲线。然后，通过比较待测样品的荧光偏振程度与标准曲线，计算出样品中待测抗原的浓度。
6.结果分析：以不同浓度的标准抗原为横坐标，以相应的荧光偏振光强度为纵坐标绘制标准曲线，从而确定样品中待测抗原的含量。
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