那天在PubMed上冲浪的时候，夏老师看到了这么一篇文章，还蛮有意思的。这篇文章是西南医科大学发表在27.7分的Cell子刊Cell Metab上的，听名字就有点意思，讲的是LRP1这个蛋白通过乳酰化促进星形胶质细胞把线粒体输送到神经元中的故事：
首先这个课题是怎么来的呢？因为在之前的一篇Nature中显示，星形胶质细胞在中风过程中，会通过将线粒体输送到神经元中，降低I/R（缺血再灌注）后的神经元损伤：
而LRP1是在缺血性卒中里，有着一定作用的一个蛋白，但是具体功能不清楚。于是他们就首先对星形胶质细胞进行了一波LRP1的敲减，来分析LRP1是否会参与线粒体的向外输送（这里其实就是反向遗传学的研究，敲除蛋白后，分析蛋白可能存在的功能，不清楚反向遗传学的话，可以看看《轻松的文学导读》）。他们首先分析了敲减LRP1后的星形胶质细胞对于线粒体的释放是否会产生变化，然后分析了敲减LRP1后对于星形胶质细胞将线粒体输送进入神经元的影响，然后在分析了敲减了LRP1后，对于缺氧诱导的神经元损伤是否有影响：
可以看得出来，他们的验证其实是循序渐进的。从线粒体的释放，到线粒体转移至神经元，再到缺氧后对神经元的影响，按部就班的验证是很能体现出这篇文章的严谨程度的。既然缺氧环境下LRP1能影响缺氧后的神经元活性以及线粒体，那么LRP1的敲除是否会影响细胞的能量代谢呢？于是他们对于这个假设进行了进一步的迭代，他们假设LRP1会影响细胞的能量代谢。于是他们进一步分析了LRP1敲减后细胞的能量代谢变化。下面的热图可以看出来敲减LRP1后糖酵解增多，而有氧呼吸相关的TCA减少，同时旁边的OCR和ECAR也显示敲减LRP1后细胞外酸化率增加（不熟悉热图的可以去看看《夏老师带你读文献》，而Seahorse实验检测能量代谢，使用会使用OCR耗氧率和ECAR细胞外酸化率图来展示，不清楚的话的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的铜死亡那几章）。同时他们用C13的同位素进行分析葡萄糖代谢状况，发现的确LRP1敲减后，会导致糖酵解途径增强，乳酸代谢增强：
那为了明确LRP1的功能，他们把能量代谢分成这么几块，然后分别进行了抑制剂抑制。通过2-DG抑制丙酮酸产生，而丙酮酸是可以分别进入TCA循环和糖酵解途径的，算是比较上游的。缺氧则是通过HIF1信号通路激活PDK转录（可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列，熟悉一下HIF1信号通路，HIF1信号通路在在缺氧环境中起到了关键的作用，不熟悉的话，要回去复习下哦）从而抑制PDH，阻碍有氧呼吸产生乙酰辅酶A。鱼藤酮则是阻止电子呼吸链的。他们还使用了一个LDH抑制剂，LDH是产生乳酸的：
结果怎么样呢？结果显示使用2-DG抑制了乳酸上游的丙酮酸合成，或者直接抑制乳酸合成。都能恢复星形胶质细胞对于线粒体的外释，并回复线粒体功能。而抑制氧化呼吸则没啥用，这也就说明乳酸可能在其中起了较大的作用，于是他们迭代了这个假设，即假设乳酸是抑制星形胶质细胞释放线粒体到神经元的关键。接着他们通过实验，也验证了这一观点：
也就是加入乳酸后，的确能使得星形胶质细胞释放的线粒体变少（这其实也是柯霍氏法则的验证，通过这个来验证乳酸对于线粒体外释的表型之间的关联性，不清楚柯霍氏法则的话可以看看《轻松的文献导读》）那么乳酸到底起到了什么样的功能呢？其实乳酸作为一个蛋白质修饰的基团，也就是可以通过对蛋白的乳酰化调控蛋白功能。于是他们假设有一个蛋白可能是受到了乳酰化的影响，产生了上述的表型。他们首先验证了LRP1敲减后泛乳酰化的影响，通过筛选，找到了可能导致表型的潜在乳酰化蛋白ARF1。并且验证了ARF1的乳酰化位于73号赖氨酸上：
接着是一个动物实验的表型，他们使用了MCAO（大脑中动脉阻塞）造了个模型，在这个模型中再进行了LRP1的敲减，发现神经元状态更为恶化。（说实话，这里为什么不是MCAO造模后过表达LRP1，而要再去敲减LRP1呢？）而线粒体在这里充当了关键的作用因子，因为他们在敲减了LRP1后直接给脑内注射线粒体，使得神经元表型得到了恢复，这也就说明了LRP1可能是通过线粒体的外释影响神经元的：
但关键问题在于LRP1敲减后，导致的乳酸增多，影响了ARF1的K73乳酰化。为了证明ARF1的K73乳酰化起到了关键的作用，他们对ARF1的K73乳酰化位点进行了突变：K73Q（类乳酰化突变）和K73R（无法乳酰化的突变），结果发现K73R的突变体可以有效促进线粒体的外释（就是下图这个红框内的图，其实已经很好地避免了肯定后件的逻辑谬误，把造成表型的关键点锁定在了ARF1的K73乳酰化上，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。接着他们又继续分析了一下乳酸与缺血性I/R的关联性：
最后就形成了这样的示意图。在缺血性卒中过程中LRP1的高表达，可以抑制葡萄糖进行糖酵解，抑制乳酸的产生。而低表达LRP1的情况下，糖酵解通量增加，乳酸产量增多，导致了ARF1的蛋白乳酰化。ARF1的K73乳酰化，则是星形胶质细胞将线粒体释放到细胞外的关键，释放出来的线粒体会进入神经元，减少神经元损伤：
这篇文章的验证其实是做得比较到位的，每一步的验证都做得很扎实。当然ARF1乳酰化后的具体机制是什么，其实并没有过多的分析。但是通过K73的突变，可以确认ARF1的确是在线粒体外释过程中比较重要的一个因素，这一步骤的验证中，其实也算是恰到好处了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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