微生物和微环境之间其实还是有很多课题可以深入挖掘的，特别是微生物的次生代谢产物对于微环境的影响。今天讲的这篇文章，就是浙江大学附属第二医院的博士生发表在45.5分的Cell上的一篇文章，讲的就是微生物次生代谢产物对于T细胞的影响，博士生期间就发Cell就真不容易了。我们来看看他们这个课题是怎么来的，又是怎么展开的吧：
首先肠道的菌群，对于肿瘤免疫微环境是有一定的影响的，同时可能会影响ICB（免疫检查点阻断）治疗。于是他们就首先假设小鼠对于αPD-1（抗PD-1抗体）治疗产生的敏感和耐受，可能受到了肠道菌群的影响。那要怎么验证呢？要排除其他微生物的背景，就需要先用抗生素对小鼠进行处理，然后使用αPD-1耐受和敏感小鼠的粪便进行移植（这其实就是柯霍氏法则的验证，通过对于αPD-1耐受和敏感小鼠的粪便移植，来确定αPD-1的疗效是否存在肠道微生物参与，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》）。他们发现移植了αPD-1敏感性小鼠，在移植瘤后，使用αPD-1治疗，也产生了敏感性：
那么问题来了，具体αPD-1敏感性小鼠肠道内的哪种微生物，是导致αPD-1敏感的呢？通过对微生物的16S核糖体 RNA 和富集，他们发现αPD-1敏感性小鼠肠道的微生物中，约氏乳杆菌的丰度要明显高于αPD-1耐受性小鼠。而分离出来的约氏乳杆菌，给小鼠进行口服后，也增强了小鼠对于αPD-1的敏感性，并增强了T细胞的细胞因子如IFNγ和TNFα的释放。那么既然是约氏乳杆菌激活肿瘤浸润的T细胞，那么到底是微生物本身的一些抗原，还是其分泌物对于T细胞的影响导致的呢？于是他们分别用热灭活的约氏乳杆菌，约氏乳杆菌培养基，约氏乳杆菌裂解物以及活菌来处理T细胞，结果发现只有培养基和活菌会影响T细胞，也就是说约氏乳杆菌激活T细胞，全凭的是分泌物：
那么具体是什么样的约氏乳杆菌代谢产物，影响了T细胞呢？他们继续进行了血浆液相色谱-串联质谱分析，结果发现约氏乳杆菌的色氨酸代谢通路明显激活。那么问题来了，色氨酸代谢，是否是激活T细胞的关键呢？色氨酸代谢底物就是色氨酸，他们就给小鼠接受了色氨酸缺乏的饮食（这里也是柯霍氏法则的验证，通过色氨酸代谢底物的缺失，来分析约氏乳杆菌具体产生分泌的关键因素是否是从色氨酸代谢过程中产生的，这样也不会产生肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以看看《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），结果发现缺乏色氨酸后，的确影响了约氏乳杆菌诱导的αPD-1敏感性。
那么问题又来了，既然是约氏乳杆菌的色氨酸代谢造成了αPD-1敏感性，而且这个代谢产物是通过约氏乳杆菌分泌造成的，那么具体是什么代谢物质诱发的呢？他们对约氏乳杆菌上调的血浆色氨酸相关代谢物进行了分析，发现了IPA（吲哚丙酸）。到这里为止，这个课题的假设已经经过了多次的迭代，现在已经不再是原有的微生物诱导了αPD-1敏感性。通过一步步地深入分析，假设已经迭代成了约氏乳杆菌代谢过程中的色氨酸代谢产物IPA会通过激活T细胞，导致宿主对于αPD-1敏感。一个课题的假设，就是通过这样一步步迭代，并进行验证，然后推进的，特别是CNS的主刊的文章中，大家可以深刻感受到这样的假设迭代的推进（不清楚假设迭代的话，可以去看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼？》系列和即将出版的《科研的逻辑和推理：从实验台到咖啡桌》）既然假设IPA是引发宿主对于αPD-1敏感的关键，那么就需要进一步验证，那么就直接通过IPA来进行实验，查看αPD-1敏感的相关表型就可以了。结果也的确显示出，约氏乳杆菌衍生的IPA，可以通过CD8+T细胞促进αPD-1的敏感性：
那么既然展示了IPA通过影响CD8+T细胞促进αPD-1的敏感性，那具体是咋影响的呢？他们对微环境的T细胞进行了单细胞测序，并对T细胞亚群进行了分簇（下图的UMAP图大家应该能看懂了吧，这个可以理解成以基因表达作为主成因的多重PCA进行降维后的图，不清楚的话，可以去看看《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》），结果发现IPA可以促进T细胞产生Tpex细胞（耗竭的T细胞前体），这群T细胞亚群能够长时间维持其功能，在T细胞耗竭后还能拥有自我更新和长期增殖的功能。也就是说IPA可以通过促进Tpex细胞，诱导和维持CD8+ T细胞的免疫反应，从而促进αPD-1的治疗敏感性：
那么IPA是怎么促进Tpex细胞增多的呢？Tpex细胞分化的关键基因，就是Tcf7，他们发现IPA可以表观调控Tcf7的转录，通过促进Tcf7的SE（超级增强子）区域的H3K27的乙酰化修饰，促进了Tcf7的转录表达，诱导激活了Tpex细胞：
但有意思的事情又来了，他们通过单独培养约氏乳杆菌后发现，约氏乳杆菌根本不能产生IPA，而只能产生ILA（吲哚-3-乳酸）。而单独给小鼠施用ILA并不能增强小鼠血浆IPA含量，也不能促进αPD-1的治疗敏感性。这课题感觉就要完蛋了……但是他们提出了新的假设，假设约氏乳杆菌需要和别的肠道微生物协同作用，才能通过ILA产生IPA，从而产生表型，而已知孢梭菌会将ILA转化为IPA。通过实验发现，的确两种细菌同时饲喂给小鼠后，的确增强了小鼠血浆的IPA含量，并且提高了αPD-1的治疗敏感性。而通过对于孢梭菌中将ILA转化为IPA的关键酶LDHA转入大肠杆菌，并施用这样的大肠杆菌和约氏乳杆菌同时移植给小鼠，确定了孢梭菌的LDHA起到了关键作用（这样的验证其实通过对于ILA转化为IPA的过程的这种细究，避免了肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以看看《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
最后他们做了一个类器官的模型，验证了IPA促进泛癌和CRC衍生类器官，对于αPD-1的治疗敏感性：
总的来说，这篇文章逐步推导的过程其实还是很值得大家认真看一下的，但其实看到两种细菌协同作用的时候，我意识到一个小问题。就是刚开始他们进行粪便移植之前，是使用了抗生素清除小鼠肠道原有微生物的，但是在后期验证约氏乳杆菌对于αPD-1的治疗敏感性的过程中，并没有进行抗生素清除，以排除其他微生物的作用。如果他们这一步严格进行抗生素的排除的话，也就是把孢梭菌清除掉之后，是不是就不能证明约氏乳杆菌的功能了呢？好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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