在《Nature》期刊发表的这篇文章中，来自堪萨斯大学的科研团队探讨了一种快速且可扩展的平台，用于在患者来源的类器官中筛选个性化反义寡核苷酸（ASO）。ASO在治疗罕见遗传病方面已取得积极成果。随着临床测序技术的进步，识别携带适合这种治疗策略的致病基因变异的罕见病患者的能力将会提高。研究者们展示了如何利用患者来源的细胞模型进行个性化ASO的临床前评估，并确认在杜氏肌营养不良症（DMD）患者来源的心脏类器官中，ASO能够逆转与疾病相关的表型。此外，他们还为两名携带DMD基因深部内含子变异的患者设计了新的个性化ASO，并证明这些ASO能够恢复DMD基因的表达并逆转疾病表型。这一方法为设计和临床前评估个性化ASO治疗罕见病提供了基础。
个性化反义寡核苷酸（ASO）在治疗罕见遗传病方面取得了积极成果。随着临床测序技术的进步，识别携带适合这种治疗策略的致病基因变异的罕见病患者的能力可能会提高。本文描述了一种可扩展的平台，用于生成患者来源的细胞模型，并展示了这些个性化模型可用于患者特异性ASO的临床前评估。研究团队开发了一种快速、稳健且可扩展的平台，用于生成患者来源的细胞模型，利用冷冻的外周血单个核细胞（PBMCs）进行诱导多能干细胞（iPS细胞）重编程，仅需3周即可建立iPS细胞系。此外，研究表明，从患者来源的iPS细胞生成的三维类器官模型能够重现疾病相关表型，并可通过患者特异性ASO逆转这些表型。该研究为个性化ASO治疗罕见病的设计和临床前评估提供了基础。反义寡核苷酸（ASO）是一种短合成核酸分子，当设计为与细胞内mRNA靶标互补时，可以影响RNA加工和/或影响蛋白质表达水平。自其在实验室首次应用以来，已有十多种不同的反义疗法在美国获批用于治疗多种疾病。ASO的序列靶向模式的固有灵活性，加上其良好的药代动力学和药效学特性，使其成为治疗遗传疾病的特别有吸引力的策略。此外，能够针对个体患者定制ASO设计对个性化治疗具有重大意义。然而，个性化ASO的设计和临床前评估的时间和成本要求过高，阻碍了这一策略的更广泛采用。通过开发一种快速、稳健且可扩展的平台，研究团队解决了这些挑战，并展示了患者来源的iPS细胞模型在评估患者特异性ASO中的效用。尽管个性化ASO在临床应用的批准方面仍需考虑大量监管因素，但本文所描述的平台将促进个性化ASO的广泛临床前开发。研究团队开发了一种快速、稳健且可扩展的平台，用于生成患者来源的细胞模型，并验证了这些模型在评估个性化反义寡核苷酸（ASO）治疗中的应用。通过利用冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMCs），该平台能够在短短3周内建立诱导多能干细胞（iPS）细胞系，并在6周内生成三维类器官模型。这些模型能够重现与疾病相关的表型，并通过患者特异性ASO进行逆转。研究中使用的ASO成功恢复了来自杜氏肌营养不良症（DMD）患者的心脏类器官中的肌营养不良蛋白表达，并逆转了与疾病相关的表型。研究还展示了个性化ASO在治疗罕见遗传病中的潜力。研究团队为两名DMD患者（兄弟）设计了新的患者特异性ASO，这些患者在DMD基因中存在深内含子变异，导致异常剪接位点的形成和转录终止。通过在患者来源的心脏类器官中应用这些ASO，研究成功恢复了DMD基因的正常表达和心脏类器官的功能。这一方法为个性化ASO治疗的设计和临床前评估提供了基础，适用于广泛的罕见疾病。
个性化治疗的潜力: 通过为每位患者设计特定的ASO，可以更有效地针对其独特的基因型进行治疗。这种个性化治疗方法可能显著改善罕见遗传疾病患者的临床结果。
加速药物开发和评估: 该平台通过缩短从患者血液细胞到细胞模型生成的时间，显著提高了ASO的开发效率。这一过程不需要复杂设备，减少了时间和成本，提高了ASO治疗的临床前评估速度。
患者衍生类器官的应用: 通过使用患者衍生的三维类器官模型，研究人员能够更准确地模拟和评估疾病表型和治疗效果。这为ASO等新疗法的评估提供了一个有效的替代动物模型的方法。
罕见疾病治疗的广泛应用: 由于平台的灵活性和可扩展性，它可以应用于多种罕见疾病的ASO治疗开发，特别是那些由于基因突变而适合ASO治疗的疾病。
对现有ASO疗法的验证: 该研究验证了现有的FDA批准的ASO治疗在患者衍生模型中恢复正常蛋白表达的能力，强调了这种方法在临床前评估中的实用性。总之，这项研究的结果为个性化ASO疗法在罕见疾病中的应用提供了强有力的证据，展示了其在改善患者临床结果方面的巨大潜力。1. 患者衍生的细胞模型生成：
使用患者的外周血单个核细胞（PBMCs）进行诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程，建立患者衍生的细胞系。
通过三维类器官模型再现疾病相关表型，并通过患者特异性ASO进行逆转。2. ASO递送和治疗评估：
描述了将ASO递送至患者衍生的类器官模型的方案。
使用含有杜氏肌营养不良症（DMD）相关基因变异的心脏类器官进行ASO疗效的评估。
针对特定患者设计了新型ASO，验证其在修复DMD基因表达和逆转疾病相关表型中的有效性。3. 实验设计和验证：
利用iPSCs生成心脏、骨骼肌和脑类器官，并检测其对疾病的相关表型。
使用不同的ASO设计策略（例如，针对翻译起始位点或剪接位点）进行基因抑制研究。
通过RT-PCR、蛋白质印迹和钙成像等技术评估ASO在类器官中的作用。4. 个性化ASO的评估：
针对特定患者的深内含子突变设计个性化ASO，并在患者衍生的心脏类器官中进行测试。
证实个性化ASO能够恢复DMD基因的正常剪接和蛋白表达，改善类器官的功能表型。
图1：用于生成患者来源细胞模型的快速可扩展平台
Figure 1 展示了从患者来源的细胞生成诱导多能干细胞（iPS细胞）及其分化为不同细胞类型的过程。
a. 实验设计和结果：该图展示了iPS细胞重编程的工作流程示意图，描述了从患者来源细胞到iPS细胞的重编程步骤。
b. 实验设计和结果：通过免疫荧光检测患者来源的iPS细胞（患者1）的iPS细胞标志物表达，结果显示这些细胞成功表达了iPS细胞特异性标志物。明场图像（BF）用于显示细胞形态。
c. 实验设计和结果：展示了患者来源的iPS细胞（患者1）的代表性核型分析，结果表明这些细胞保持正常的染色体结构。
d. 实验设计和结果：通过分化实验，患者来源的iPS细胞（患者1）被成功分化为外胚层、内胚层和中胚层谱系，显示其多能性。
e. 实验设计和结果：使用患者来源的iPS细胞（患者1）进行胚状体形成实验，结果表明这些细胞能够形成胚状体。
f. 实验设计和结果：通过分化实验，患者来源的iPS细胞（患者1）被成功分化为二维骨骼肌细胞，显示其分化潜力。
g. 实验设计和结果：通过分化实验，患者来源的iPS细胞（患者1）被成功分化为三维心脏和脑类器官，显示其复杂组织结构的形成能力。
h. 实验设计和结果：展示了重编程结果相对于外周血单个核细胞（PBMC）输入细胞数量的关系，表明重编程效率与输入细胞数量之间的关系。
结论：该图展示了一种快速且可扩展的平台，可以从患者来源的细胞生成iPS细胞，并进一步分化为多种细胞类型和组织结构，验证了其在生成患者特异性细胞模型中的应用潜力。
图2：使用反义寡核苷酸（ASOs）在类器官系统中进行稳健的基因干扰
Figure 2 展示了使用反义寡核苷酸（ASOs）在心脏类器官中进行基因干扰的实验设计和结果，重点在于心脏肌钙蛋白T的表达和心脏类器官的收缩功能。
A. 实验设计策略示意图，展示了针对心脏肌钙蛋白T的ASOs设计策略。
B. 为了检测心脏肌钙蛋白T在心脏类器官中的表达，作者对处理过ASOs的心脏类器官进行了表达分析，结果显示心脏肌钙蛋白T的表达水平发生变化。该数据代表了3个生物学独立实验的结果。
C. 通过免疫印迹验证了心脏类器官中心脏肌钙蛋白T的表达，结果确认了ASOs处理后心脏肌钙蛋白T的表达水平变化。该数据同样代表了3个生物学独立实验的结果。
D. 为了评估心脏类器官的收缩功能，作者通过检测细胞内钙离子水平来确定单个心脏类器官的收缩情况，结果表明ASOs处理影响了心脏类器官的收缩。
E. 总结了处理过ASOs的心脏类器官的收缩情况，数据以平均值±标准差呈现，误差线表示100个独立类器官的3次计数的标准差。
结论：使用反义寡核苷酸（ASOs）可以有效地在心脏类器官中进行基因干扰，影响心脏肌钙蛋白T的表达和类器官的收缩功能。
图3：在患者来源的类器官疾病模型中分析现有反义寡核苷酸（ASO）疗法的活性Figure 3 旨在通过患者来源的类器官模型，分析现有ASO疗法在治疗杜氏肌营养不良症（DMD）中的活性。
a. 为了分析现有ASO疗法在治疗DMD中的活性，作者设计了一种策略来分析这些ASO疗法在患者来源的类器官模型中的表现。
b. 通过色谱图验证患者1的DMD基因中结构性缺失，结果显示患者1的DMD基因存在结构性缺失。
c. 通过靶向RNA测序验证患者1表达的DMD转录本中缺失的外显子，结果显示患者1的DMD转录本中确实存在外显子缺失。
d. 在来自DMD患者（患者1）的心脏类器官中，使用与现有ASO疗法序列匹配的ASO进行处理，检测到抗肌萎缩蛋白的表达。
e. 对比未受影响的心脏类器官，定量分析显示在来自DMD患者（患者1）的心脏类器官中，抗肌萎缩蛋白的表达有所增加。
f. 通过免疫印迹验证在使用与现有ASO疗法序列匹配的ASO处理的DMD患者（患者1）来源的心脏类器官中，抗肌萎缩蛋白的表达得到确认。
g. 分析患者来源的心脏类器官（患者1）中ASO转染的效率，结果显示ASO转染效率较高。
h. 在使用与现有ASO疗法序列匹配的ASO处理的DMD患者（患者1）来源的心脏类器官中，分析含有外显子45与跳过外显子45的DMD转录本的相对表达，结果显示外显子45的跳过得到了有效的调控。
i. 在使用与现有ASO疗法序列匹配的ASO处理的DMD患者（患者1）来源的心脏类器官中，观察到个体心脏类器官的收缩。
j. 通过时间序列分析，观察到在使用与现有ASO疗法序列匹配的ASO处理的DMD患者（患者1）来源的心脏类器官中，收缩功能得到了恢复。
k. 分析使用ASO处理的DMD患者（患者1）来源的心脏类器官的存活率，结果显示类器官的存活率较高。
结论：现有ASO疗法在患者来源的类器官模型中表现出对DMD的治疗潜力，能够有效恢复抗肌萎缩蛋白的表达和心脏类器官的收缩功能。
图4：患者特异性ASOs在患者来源类器官中的设计和临床前评估
Figure 4 展示了针对DMD患者设计的特异性反义寡核苷酸（ASOs）的临床前评估过程。
a. 为了评估新型患者特异性ASOs的临床前效果，作者设计了一个策略示意图，展示了ASOs的设计和应用流程。
b. 通过染色体图谱验证了患者2a的DMD基因内含子变异，确认了该变异的存在。
c. 通过免疫荧光检测DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官中，使用患者特异性ASOs处理后的抗肌萎缩蛋白表达情况，结果显示处理后抗肌萎缩蛋白的表达增加。
d. 通过定量分析，比较了DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官与正常心脏类器官中抗肌萎缩蛋白的表达水平，结果表明患者特异性ASOs处理后，患者来源类器官中抗肌萎缩蛋白的表达显著提高。
e. 通过免疫印迹验证了DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官中，使用患者特异性ASOs处理后的抗肌萎缩蛋白表达，结果显示处理后抗肌萎缩蛋白的表达得到确认。
f. 通过RT-PCR验证了DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官中，使用患者特异性ASOs处理后恢复的外显子43-44的剪接，结果显示剪接恢复。
g. 观察DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官在患者特异性ASOs处理后的收缩情况，结果显示类器官的收缩能力得到改善。
h. 通过时间进程分析，评估了DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官在患者特异性ASOs处理后的收缩恢复情况，结果显示收缩能力随时间逐渐恢复。
i. 评估了患者来源心脏类器官（患者2a）中ASOs转染的效率，结果显示转染效率较高。
j. 评估了DMD患者（患者2a）来源的心脏类器官在ASOs处理后的存活率，结果显示处理后类器官的存活率良好。
结论：患者特异性ASOs在DMD患者来源的心脏类器官中有效恢复了抗肌萎缩蛋白的表达和功能，显示出良好的临床前应用潜力。
这篇文章介绍了一种快速、可扩展的个性化反义寡核苷酸（ASO）筛选平台，利用患者来源的类器官进行个性化治疗评估。研究展示了该平台在生成患者来源的细胞模型方面的应用，并验证了这些模型在评估患者特异性ASO治疗中的实用性。通过对Duchenne肌营养不良症（DMD）患者来源的心脏类器官进行研究，研究人员证明了ASO治疗可恢复DMD基因表达，并逆转与疾病相关的表型。研究显示，这一平台能够为多种罕见疾病的个性化ASO治疗设计和临床前评估提供基础。
文章讨论了ASO治疗能够根据个体患者进行定制，使其成为个性化医学中的一种有吸引力的策略。通过开发一种快速、稳健和可扩展的平台来生成患者来源的细胞模型，研究团队验证了这些模型在评估患者特异性ASO中的应用。虽然个性化ASO的临床批准仍需考虑诸多监管因素，但该平台为个性化ASO的广泛临床前开发提供了便利。此外，患者来源的类器官系统作为药物开发中的动物模型替代方案，能够在不到两个月的时间内生成，并且能够模拟疾病表型。研究表明，类器官系统可以用于广泛的药物开发方法，不仅限于ASO，还可以用于高通量化合物筛选等。该平台的普及将对理解疾病机制和开发治疗罕见疾病的新方法产生重大影响。
