精子发生异常是男性不育的最主要致病因素，其中减数分裂是精子发生的一个独特事件，是哺乳动物产生雄性配子的关键步骤，经历减数分裂起始、同源重组修复、染色体分离、性染色体失活和减数分裂退出等过程。精子发生过程中的基因表达调控比较复杂，在减数分裂的起始阶段（meiotic entry）和减数分裂的退出阶段（meiotic exit），存在两个转录高峰，发生重要的基因表达重编程过程。尽管针对减数分裂起始的转录调控机制已取得多个重要进展，已鉴定STRA8是减数分裂起始的关键转录因子，在信号分子视黄酸的诱导下，激活减数分裂相关基因组，生精细胞分化进入减数分裂。但减数分裂退出阶段的转录调控机制一直是领域的难题，关于生精细胞如何关闭减数分裂转录组，同时激活单倍体圆形精子发育特异转录组仍不清楚。2025年 1月 17日，南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室叶岚教授、顾亚云教授，美国贝勒医学院孙正教授和南京医科大学神经生物学系林明焰教授等课题组合作，在Nature Communications在线发表了题为NKAPL facilitates transcription pause-release and bridges elongation to initiation during meiosis exit 的研究论文，揭示了睾丸特异表达蛋白NKAPL调控减数分裂的功能。
该研究建立在减数分裂退出阶段转录起始复合物SOX30/HDAC3的研究基础上，与叶岚课题组2018年在Development杂志发表的Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes和2021年Nucleic Acids Research杂志发表的研究论文HDAC3 controls male fertility through enzyme-independent transcriptional regulation at the meiotic exit of spermatogenesis 密切联系。前期的研究表明，SOX家族成员SOX30特异表达于生殖细胞中，在中晚期精母细胞和单倍体圆形精子高度富集，并含有进化上保守的DNA-binding结构域HMG-Box。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）结果显示，Sox30选择性结合‘ACAAT’DNA序列，证明其是在晚期精母细胞和早期圆形精子细胞激活单倍体基因的关键转录因子。SOX30敲除鼠的精子发生阻滞在早期圆形精子阶段，在减数分裂退出阶段与组蛋白去乙酰化酶HDAC3形成转录起始复合物，并以非去乙酰化酶依赖的方式促进基因的转录调控。尽管HDAC3对组蛋白进行去乙酰化修饰，通常抑制靶基因的表达，但在棕色脂肪、消化系统和生精细胞中，去乙酰化酶HDAC3结合组织特异性转录激活因子，促进基因转录。通过进一步免疫沉淀结合质谱技术分析和鉴定减数分裂退出阶段转录起始复合物的蛋白质相互作用网络，猜测睾丸特异表达蛋白NKAPL与减数分裂退出阶段的转录起始复合物SOX30/HDAC3存在关联。Nkapl是X染色体上的Nkap基因逆转录到常染色体上的逆转座基因，而Nkap在免疫系统中曾报道与HDAC3形成蛋白复合物抑制基因的转录。为了探索NKAPL在精子发生中的生物学功能，利用CRISPR/Cas9构建Nkapl基因敲除鼠，NKAPL缺失导致生精细胞在减数分裂退出阶段出现发育异常，XII期生精管腔出现晚期精母细胞的凋亡，大部分生精管腔停滞在早期圆形精子阶段，与Stra8-cre介导的睾丸特异性Hdac3或Sox30基因全敲导致减数分裂退出缺陷的现象类似。选取出生后21天龄野生型与Nkapl敲除鼠以及分选细胞的转录组分析结果显示，与预期结果相反，NKAPL缺失引起大量单倍体精子细胞发育相关基因的下调，这与生精细胞中缺乏SOX30或HDAC3而导致的转录组变化相似。这些结果表明NKAPL、SOX30和HDAC3可能在同一信号通路调控减数分裂退出阶段单倍体基因的转录。
图1. Nkapl KO小鼠睾丸中下调的基因与Sox30 KO和Hdac3 cKO睾丸中下调的基因具有相似性（引自原文Figure 2部分图像）
染色质免疫沉淀分析结果显示，NKAPL主要结合靶基因的启动子区域，结合位点位于转录起始复合物SOX30/HDAC3结合位点的下游。NKAPL敲除不影响SOX30 与HDAC3 之间的相互作用，但显著增加SOX30/HDAC3复合物与靶DNA之间的亲和力。这些结果提示，NKAPL缺失介导的单倍体精子细胞发育相关基因的下调可能与转录起始复合物SOX30/HDAC3在染色质发生停滞有关。高等动物RNA聚合酶II介导的转录是一个高度协调的过程，涉及转录起始、启动子近端暂停、转录延伸、转录终止的动态转变，如果转录起始一步出现阻滞，RNA Pol II的招募可能出现问题。然而，与预期结果相反，野生型和Nkapl敲除鼠的RNA Pol II ChIP-seq显示，RNA Pol II 在单倍体发育基因启动子区域富集水平上升。通过计算和比较野生型和Nkapl KO RNA Pol II 在启动子近端的迁移比率，发现NKAPL缺失导致RNA Pol II在启动子近端的迁移比率上升，提示RNA Pol II在靶基因近端启动子的停顿增加。NKAPL ChIP-seq进一步提示NKAPL染色质结合信号与启动子近端Pol II峰型重叠。综上结果，NKAPL特异调控RNA Pol II在启动子近端的停顿释放，是减数分裂退出阶段的转录延伸因子。
转录早期，Pol II通常会暂停在转录起始点下游200 bp窗口内发生短暂停顿, 称作启动子近端暂停，是转录的关键调控步骤，与mRNA剪切加工过程密切相关。由于NKAPL蛋白含有精氨酸和丝氨酸（arginine/serine-rich）的RS结构域，具有潜在结合RNA的能力，可能通过招募新生RNA调控Pol II转录复合物的启动子近端停顿。运用增强型共价交联免疫沉淀（eCLIP）技术，获得睾丸内源性NKAPL直接结合的靶RNA，经RNA纯化和构建NKAPL-eCLIP测序文库, 鉴定NKAPL靶向结合RNA主要为新生RNA，富集于启动子下游40 bp，并特异性识别和结合含GAA串联序列的RNA。文献报道GAA串联序列富集于植物拟南芥转录过程中形成的R-loop结构，生信分析提示GAA串联序列在哺乳动物R-loop富集，提示R-loops生成优先发生在高等真核生物基因组的保守基因热点。R-loop是转录产生的大量新生RNA链与打开的双链DNA其中一条链发生碱基互补配对，形成RNA-DNA杂合链，同时与未配对的另一条DNA链游离在外组成的三方结构。进一步运用DNA:RNA杂合链免疫共沉淀高通量测序技术（ssDRIP-seq）捕获生精细胞中的R-loop图谱。生精细胞R-loop信号在基因启动子附近分布较高，研究人员将前期NKAPL eCLIP-seq结合位点和R-loop图谱进行联合分析，NKAPL eCLIP信号在生精细胞R-loop附近显著富集。NKAPL敲除后的进一步研究表明，NKAPL缺失导致启动子附近的平均R-loop信号显著减少，综上结果提示NKAPL有助于R-loop的生物合成。综上，减数分裂退出阶段的转录延伸因子NKAPL与新生RNA结合，通过调控转录过程中的R-loop，促进paused Pol II的释放，实现减数分裂退出转换期单倍体基因的高效转录。图3. NKAPL特异调控RNA Pol II在启动子近端停顿释放的机理（引自原文Figure 6部分图像）最后，为了探讨NKAPL功能障碍在人类精子发生中的作用，研究人员在人类非梗阻性无精子症患者中鉴定出4例低频、高效应的NKAPL基因突变位点，包括3例错义突变和1例移码突变，负荷检验表明这些突变与NOA风险增加显著相关。基于人群发现，研究人员进一步构建了Nkapl移码突变敲入小鼠，发现Nkapl突变雄鼠不育，呈现与NKAPL敲除鼠类似的减数分裂退出阶段的发育缺陷，表明NKAPL蛋白第349位的功能缺失突变是男性不育潜在的遗传致病因素。南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室叶岚课题组博士康振龙、徐晨，胡志斌课题组博士后陆帅博士，叶岚课题组硕士龚洁、阎若禹（林明焰课题组联合培养）和罗干为论文的主要贡献作者，南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室叶岚教授和顾亚云教授、美国贝勒医学院孙正教授与南京医科大学林明焰教授为本文共同通讯作者。https://doi.org/10.1038/s41467-024-55579-y制版人：十一
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