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东华大学史向阳教授团队 Nano Today：基于含磷树状大分子的药物递送系统协同增强自噬、抗炎和抗氧化治疗阿尔茨海默症

高分子科技 · 公众号 · 化学 · 2025-02-11 12:08

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阿尔茨海默病（ AD ）是最常见的神经退行性疾病之一，其特点是神经元逐渐退化，导致认知能力逐渐下降。随着病情的发展，患者可能完全丧失生活自理能力，难以适应周围环境。 AD 的发病机制错综复杂，包括 β- 淀粉样蛋白（ Aβ ）的异常聚集、激活的小胶质细胞引发氧化应激和神经炎症、神经元功能障碍等，加上血脑屏障（ BBB ）带来的巨大挑战，极大地阻碍了治疗药物向病灶区域的有效输送。目前的单药疗法只能针对 AD 发展过程中的特定方面，而在解决整个病理途径的疗效有限。寻求全面调节脑部炎症微环境以有效改善 AD 病理的治疗策略至关重要。

自噬被广泛认为是一种自我保护机制，它能使细胞承受各种环境压力，如营养或生长因子匮乏、缺氧、活性氧（ ROS ）或 DNA 损伤。加强细胞自噬以加速 Aβ 聚集体的分解和代谢被认为是一种很有前景的治疗策略，尤其是在神经退行性疾病中。雷帕霉素（ Rap ）可通过调节小胶质细胞活性和减少促炎介质的分泌，因而具有抗神经炎和神经保护特性。此外， Rap 通过抑制 mTOR 活性促进自噬体形成，促使自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，可有效清除神经元细胞中受损或异常积累的蛋白质，如 Aβ 和 α- 突触核蛋白。

纳米平台的开发为有效治疗 AD 提供了新途径。其中，羟基封端的含磷树状大分子不仅可以作为纳米载体有效穿透 BBB ，实现大脑的靶向给药，而且还表现出独特的生物特性，如抗炎和免疫调节活性。这些树状大分子在发挥内在生物活性的同时，还能抑制异常蛋白质聚集，因而在治疗神经退行性疾病方面具有双重潜力。与此同时，纤连蛋白（ FN ）通过抑制核因子卡巴 -B （ NF-κB ）信号通路、减少促炎因子的表达以及促进巨噬细胞向 M2 表型转化，表现出显著的抗炎和抗氧化特性。 FN 在治疗神经退行性疾病方面大有可为，特别是由于其 Arg-Gly-Asp(RGD) 序列可促进其靶向小胶质细胞表面整合素，增强其调节神经炎症和氧化应激的能力。在近期的工作中，团队构建了亚磷酸钠或羟基封端的含磷树状大分子 /FN 纳米药物，通过结合树状大分子自身的抗炎活性以及 FN 的抗炎抗氧化活性协同缓解巨噬细胞或小胶质细胞内氧化应激，促进 M2 分型，降低炎症反应，成功用于急性肺损伤 / 痛风、缺血性脑卒中和帕金森病的抗炎 / 抗氧化治疗（ ACS Nano 2024, 18, 2195-2209; Adv. Healthcare Mater. 2024, 13, 2401462; Bioact. Mater. 2024, 38, 45-54 ）。

基于此， 东华大学史向阳教授团队与法国国家科学研究中心 Jean-Pierre Majoral 院士团队 合作构建了自身具有生物活性的羟基化的含磷树枝状大分子负载 FN 和 Rap 的纳米复合物（ R@A/F NCs ），旨在利用综合抗炎、抗氧化和自噬增强特性来高效治疗 AD （图 1 ）。第一代羟基端含磷树状大分子（ AK76 ）通过静电作用、氢键作用、阳离子 -π 作用和疏水作用与 FN 复合，并通过疏水作用进一步负载 Rap 。形成的 R@A/F NCs 具有良好的稳定性、细胞相容性和靶向性能。 R@A/F NCs 能在体外通过降低 ROS 水平、恢复线粒体膜电位（ MMP ）、增强自噬、促进小胶质细胞 M2 极化和抑制炎性细胞因子分泌等方式协同调节小胶质细胞。在树状大分子末端羟基的帮助下， R@A/F NCs 可以穿过 BBB ，并通过减轻脑部炎症、刺激自噬和促进 Aβ 蛋白降解来修复 AD 小鼠模型的认知和记忆损伤。

图 1. R@A/F NCs 的合成及其用于 AD 的联合治疗示意图。

研究团队发现当 AK76/FN 的质量比为 2 时，形成的纳米复合物（ NCs ）具有最佳的水动力学直径和较小的多分散指数（ PDI ，图 2A ），所形成的 NCs 都显示负的表面电位，这是由于 FN 的负电荷在与 AK76 复配后保持不变（图 2B ）。制备的 A/F NCs 与 R@A/F NCs 呈现球形，在负载 Rap 后，尺寸由 144.4 nm 增加到 187.3 nm （图 2C-D ）。细胞毒性实验结果表明 R@A/F NCs 对 BV2 细胞和 SH-SY5Y 细胞具有良好的细胞相容性（图 2E ）。用 R@A/F-Cy5.5 NCs 处理的 BV2 细胞内的荧光强度远高于用游离 FN-Cy5.5 处理组（图 2F-G ）。细胞吞噬机制探究结果表明，大多数 R@A/F NCs 能通过网格蛋白依赖和巨胞饮介导的途径被 BV2 细胞有效吸收，同时依赖于 RGD 介导的内吞途径。

图 2. （ A ）不同 AK76/FN 质量比（ 1 、 2 、 4 、 6 、 8 或 10 ）下 AK76 、游离 FN 或 A/F NCs 的水动力学直径和 PDI 以及（ B ） zeta 电位。（ C ） AK76/FN 质量比为 2 时 R@A/F NCs 的 TEM 图像和（ D ）尺寸分布直方图。（ E ） SH-SY5Y 和 BV2 细胞经不同浓度 AK76 的 R@A/F 处理后的活力。（ F ）用 PBS 、游离 FN-Cy5.5 或 A/F-Cy5.5 NCs 处理 BV2 细胞后的相对荧光强度。（ G ） CLSM 观察用 FN-Cy5.5 或 R@A/F-Cy5.5 NCs 培养 8 小时后 BV2 细胞内的荧光。（ H ）用多种抑制剂预处理后再用 R@A/F-Cy5.5 NCs 培养 2 小时的 BV2 细胞的流式细胞术直方图。

研究团队通过 WB 测试发现 R@A/F NCs 的处理能够明显降低 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 P62 蛋白（主要负责标记细胞内受损的蛋白质以通过自噬体降解）表达量，上调 ATG5 蛋白（自噬体形成和成熟的关键蛋白）的表达，表明有效促进线粒体自噬（图 3A-B ）。通过 CLSM 观察到 R@A/F NCs 的处理使得激活的 BV2 细胞的 MMP 恢复正常，促进线粒体平衡（图 3C ）。同时， R@A/F NCs 通过降低细胞内 ROS 的产生以缓解氧化应激（图 3D-E ）。联合 AK76 的抗炎活性和 FN 的抗炎 / 抗氧化活性， R@A/F NCs 促进小胶质细胞 M2 极化，显著降低促炎细胞因子包括 TNF-α 、 IL-1β 和 IL-6 的分泌（图 3F-I ）。通过量化免疫染色结果，我们发现 R@A/F NCs 处理导致 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 p-p65 表达显著下调，表明 R@A/F NCs 能够有效抑制 NF-κB 通路的激活，增强其抗炎功效（图 3J ）。

图 3. （ A ） WB 检测分析不同处理后 Aβ 处理的 BV2 细胞中 P62 和 ATG5 的蛋白表达水平。（ B ） P62 蛋白相对表达量的定量分析。（ C ） CLSM 检测不同材料处理的 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 MMP 变化。（ D ） CLSM 观察不同处理后 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 ROS 的表达。（ E ）不同处理后 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 ROS 表达的平均荧光强度。（ F ）通过流式细胞术评估不同处理后 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 CD86 和 CD206 的表达水平。 ELISA 分析 BV2 细胞中（ G ） TNF-α 、（ H ） IL-1β 和（ I ） IL-6 的分泌水平。（ J ）通过 CLSM 观察分析不同处理后 Aβ 挑战的 BV2 细胞中 p-p65 的相对表达水平。

研究团队发现与 FN-Cy5.5 组相比， R@A/F-Cy5.5 NCs 组在 AD 小鼠脑部的荧光信号明显增加，并在注射后 6 小时达到峰值。这表明， R@A/F NCs 成功穿透 BBB 并在大脑中蓄积，这可能是由于 AK76 含磷树状大分子表面的羟基引起的。在静脉注射后 6 小时，肝脏和肾脏区域的荧光强度升高表明 R@A/F-Cy5.5 NCs 和 FN-Cy5.5 可通过网状内皮系统被有效清除，凸显了 R@A/F NCs 卓越的脑靶向和清除特性（图 4 ）。

图 4. （ A ）小鼠活体成像照片和（ B ）尾静脉注射 R@A/F-Cy5.5 和 FN-Cy5.5 后 0 、 0.5 、 1 、 2 、 4 和 6 h 脑区的荧光值。（ C ）注射 R@A/F-Cy5.5 或 FN-Cy5.5 后 6 小时小鼠离体器官荧光成像照片和（ D ）主要器官（包括肺、心、肝、肾、脾和脑）的荧光值。

由于 NCs 具有显著的氧化应激缓解作用、抗炎特性、 BBB 通透性和精确靶向能力，研究团队进一步通过新物体识别（ NOR ）测试、 Y 迷宫测试和莫里斯水迷宫（ MWM ）测试以评价 R@A/F NCs 的体内疗效（图 5A ）。在 NOR 测试中， R@A/F NCs 处理后，识别指数最高，能够明显恢复 AD 小鼠对新奇事物的探索兴趣，改善小鼠的认知功能（图 5B-C ）。 Y 迷宫测试结果显示 R@A/F NCs 治疗的 AD 小鼠在新臂上探索的时间显著增加，表明 R@A/F NCs 能够缓解记忆缺陷。 MWM 测试结果表明， R@A/F NCs 组的 AD 小鼠在目标象限内的游泳时间显著增加，逃逸潜伏期在除正常组以外的所有治疗组中最短，穿越平台的次数增加，反映出 R@A/F NCs 治疗后小鼠的记忆和学习能力明显提高（图 5D-G ）。

图 5. （ A ） AD 小鼠的治疗和测试安排。（ B ）不同组别 AD 小鼠在 NOR 测试中的代表路径。（ C ）根据（ B ）计算的识别指数量化。（ D ）不同组别小鼠在 MWM 测试中的游泳轨迹。红点表示起点，黑点表示终点。（ E ）不同组小鼠在目标象限内的时间、（ F ）逃逸潜伏期和（ G ）穿越平台的次数。

研究团队进一步研究了 R@A/F NCs 治疗的潜在机制。体内结果显示， R@A/F NCs 可有效降低脑内 Aβ 的积聚以及电离钙结合适配分子 -1 （ IBA-1 ）和胶质纤维酸性蛋白（ GFAP ）等活化标志物的表达，表明大脑中的炎症状态得到有效缓解。 R@A/F NCs 处理后，脑内 ROS 水平下降最为明显，表明纳米药物中的各种成分具有协同作用，可通过 Rap 诱导自噬，并通过 Rap 和 FN 消除 ROS 。 WB 结果表明， R@A/F 组处理后脑内 mTOR 表达水平最低，同时 ATG5 蛋白增加最多，自噬底物 P62 减少最明显。 CD206 和 CD86 的免疫荧光分析进一步显示， R@A/F NCs 处理导致小鼠脑内 CD86 水平显著降低， CD206 表达明显升高，表明脑内小胶质细胞的有效 M2 再极化。此外，经 R@A/F NCs 治疗的小鼠脑部海马细胞出现了良好的组织结构，神经元数量明显恢复，与健康小鼠相当（图 6 ）。

图 6. （ A ）不同组小鼠脑部 Aβ 、 IBA-1/GFAP 和 ROS 的免疫荧光图像。（ B ） Aβ 、（ C ） GFAP 和（ D ） IBA-1 在不同组中的相对表达量。（ E ） mTOR 、 ATG5 和 P62 的 WB 表达分析。（ F ）不同处理后小鼠脑部 CD86/CD206 的免疫荧光染色。（ G ）不同组海马区的 H&E 染色和神经元的 Nissl 染色。

简而言之，该研究设计的纳米药物具有以下优势：（ 1 ）以含磷树状大分子为基础的递送系统显著提高了 FN 和 Rap 的生物利用度，同时末端羟基赋予 NCs 穿透受损 BBB 的能力，通过 FN 介导靶向过表达 α ₄ β ₁ 整合素的小胶质细胞，促进纳米药物靶向递送至 AD 病变部位；（ 2 ） R@A/F NCs 可协同 AK76 、 FN 和 Rap 的抗炎和抗氧化作用，促进氧化应激缓解、线粒体功能恢复、自噬增强和诱导小胶质细胞 M2 极化，从而协同抑制 Aβ 的聚集并改善 AD 认知缺陷。所开发的纳米药物结合了生物活性含磷树状大分子和多组分药物治疗 AD 的优势，有望用于不同神经退行性疾病的免疫调节治疗。

以上研究成果以 “Codelivery of Fibronectin and Rapamycin via Bioactive Phosphorus Dendrimers to Ameliorate Alzheimer’s Disease through Macrophage Autophagy, Oxidative Stress Alleviation and Polarization Modulation” 为题，在线发表于国际著名期刊 Nano Today （ DOI: 10.1016/j.nantod.2025.102664 ）。东华大学生物与医学工程学院 史向阳教授 为通讯作者，东华大学博士生 詹梦偲和 硕士生 戴外从 为共同第一作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科委等项目及中央高校基本科研业务费专项资金的资助。

文章链接：

https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102664

东华大学史向阳教授团队 Nano Today：基于含磷树状大分子的药物递送系统协同增强自噬、抗炎和抗氧化治疗阿尔茨海默症

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