摘要：
本文聚焦基于工程腺相关病毒（AAV）载体的新型疫苗平台。研究人员通过改造 AAV2 和 AAV9 衣壳，引入新冠病毒受体结合域（RBD）构建 AAV.RBDs。实验表明，AAV.RBDs 具备新冠病毒特性，能引发强烈且特异性免疫反应，
在疫苗研发领域极具潜力，有望为传染病防控带来新突破 。
一、疫苗研发新征程：AAV 载体的创新尝试
在疫苗研发的漫漫征途中，传统疫苗技术在应对复杂多变的病原体时，常常面临诸多挑战。随着科技的迅猛发展，新型疫苗技术成为科研人员探索的重点方向，其中基于腺相关病毒（AAV）载体的疫苗研发备受瞩目。AAV 作为基因治疗领域的 “常客”，具有低免疫原性、良好的组织靶向性等优势。那么，它能否在疫苗研发领域开辟出一片新天地呢？（此处可插入 AAV 病毒结构示意图，展示其由衣壳和单链 DNA 基因组构成，帮助读者理解 AAV 的基本结构）
研究人员别出心裁，试图将 AAV 载体改造成呈现免疫原性抗原的理想支架，以此激发机体对病原体的强烈特异性免疫反应。他们以新冠病毒为 “试验田”，将目光锁定在新冠病毒刺突蛋白的受体结合域（RBD）上。这个 RBD 区域在病毒感染细胞的过程中扮演着关键角色，并且具有高度免疫原性。研究人员把 RBD 的部分氨基酸序列引入 AAV2 和 AAV9 的衣壳表面可变环区域，构建出了 AAV2.RBD 和 AAV9.RBD 衣壳（统称 AAV.RBDs），就此开启了 AAV 载体在疫苗研发领域的创新之旅。
二、精心构建与验证：AAV.RBDs 的诞生之路
研究人员对 AAV.RBDs 进行了细致的设计与构建。通过基因工程技术，把编码 RBD 的序列精准插入到 AAV2 和 AAV9 衣壳蛋白的特定位置（如图 S1B 所示，展示 RBD 插入 AAV2 衣壳蛋白的位置示意 ）。利用 AlphaFold2 进行的计算机模拟预测显示，AAV2.RBDv1 的结构保留了 AAV 的二十面体形状，RBD 插入后在衣壳表面呈现出规则的分布（图 1A - C ）。
图 1：Predicted structure of engineered AAV.RBD capsid
从图 1A 中可以清晰看到，AAV2.RBDv1 的单个 VP3 单体上，与新冠病毒 RBD（橙色）结构相似的部分（蓝色）突出显示；图 1B 展示了 AAV2 的 60 聚体衣壳；图 1C 则从 5 重轴方向展示了预测的组装后的 60 聚体衣壳结构，RBD 结构域清晰可见，这些都为后续研究提供了重要的理论基础。
为了测试 AAV.RBDs 的功能，研究人员将其制备成携带报告基因（eGFP）的载体，并在 HEK293T 细胞中进行转导实验。同时，他们还制备了不含载体基因组的病毒样颗粒（VLPs）。通过 AAVx 亲和层析实验发现，AAV.RBDs 无论是携带基因组的载体还是空的 VLPs，都能被有效纯化，其结合和洗脱曲线与野生型 AAV2 具有相似性，但也存在一些差异（图 2A - C ）。从图 2A 中 AAV2 WT 载体的洗脱曲线，到图 2B 中 AAV2.RBDv1 载体稍向更高洗脱体积偏移的曲线，再到图 2C 中 AAV2.RBDv1 空 VLPs 进一步偏移的曲线，可以直观地看出 AAV.RBDs 的特性变化。进一步的检测发现，AAV.RBDs 载体的基因组滴度比野生型 AAV 低，但衣壳滴度仅低一个数量级（图 2D - E ），这表明 AAV.RBDs 在形成多聚体衣壳时可能存在包装效率低或稳定性差的问题。
图 2：AAVx affinity chromatography and titers of AAV.RBDs
三、功能探索：AAV.RBDs 的细胞 “亲和力” 表现
接下来，研究人员探究了 AAV.RBDs 的转导效率。由于新冠病毒通过 RBD 与血管紧张素转化酶 2（ACE2）受体结合进入细胞，研究人员推测，表面展示 RBD 的 AAV.RBDs 可能也能利用这一机制进入细胞。在实验中，他们分别在普通 HEK293T 细胞和稳定过表达 ACE2 的 HEK293T 细胞（ACE2-OE-HEK293T）中进行转导实验。
结果显示，AAV2 WT 在 HEK293T 细胞中具有较高的转导效率，且 ACE2 的过表达对其转导效率影响不大。而 AAV2.RBDv2 在 HEK293T 细胞中的转导效率较低，但在 ACE2-OE-HEK293T 细胞中，其转导效率显著提高（图 3A - B ）。从图 3A 的代表性荧光图像中，可以直观地看到不同细胞在不同 MOI（感染复数）下的转导情况；图 3B 的量化数据进一步证实了这一结论，在 1,000 vg/cell 的 MOI 下，AAV2.RBDv2 在 ACE2-OE-HEK293T 细胞中的转导效率达到了与 AAV2 WT 相当的水平。这一结果间接证明了 AAV.RBDs 载体上的 RBD 能够与 ACE2 受体功能性结合，为其在疫苗研发中的应用提供了有力的支持。
图 3：Transduction properties of AAV2 WT and AAV2.RBDv2
四、免疫原性评估：引发强烈免疫反应的有力证据
AAV.RBDs 在疫苗研发中的关键作用是激发机体的免疫反应，因此研究人员对其免疫原性进行了深入研究。他们用 AAV.RBDs VLPs 和野生型 AAV VLPs 免疫兔子，在不同时间点采集血清，检测 RBD 特异性 IgG 浓度。结果令人惊喜，所有 AAV.RBDs 变体都诱导出了强烈的 IgG 抗体反应，而野生型 AAV 衣壳则没有引发明显的反应（图 4B ）。
进一步分析发现，AAV2.RBDv2 免疫兔子后，IgG 和 IgM 抗体的变化趋势不同（图 4C ）。IgG 抗体在首次加强注射后就几乎达到最大值，而 IgM 抗体则在开始时水平较低，随着加强注射逐渐升高。通过点杂交实验，研究人员证实了 AAV.RBDs 变体中存在 RBD 序列，且能与抗 SARS-CoV-2 刺突 S1 特异性抗体结合（图 4D ）。用免疫兔子的血清与 AAV.RBDs 和野生型 AAV 载体进行点杂交实验，也观察到血清与 AAV.RBDs 变体有强烈反应（图 4E ），这表明血清中存在针对 RBD 的抗体。
不仅如此，研究人员还发现 AAV.RBDs 免疫兔子的血清能有效中和 AAV.RBDs 载体的转导，且对 AAV2.RBDv2 的抑制作用更强（图 4F - G ），这意味着血清中含有高水平的 RBD 特异性中和抗体（NAbs）。这些结果充分表明，AAV.RBDs 能够在体内引发强烈的体液免疫反应。
图 4：Evaluation of rabbits with AAV.RBD VLPs
五、人体实验验证：AAV.RBDs 的 “实战” 成果
在兔子实验取得良好结果后，研究人员将目光转向人体实验。他们用接种过新冠 mRNA 疫苗 Comirnaty 的个体血浆与 AAV.RBDs 进行实验，探究人体抗 SARS-CoV-2 刺突抗体是否能与 AAV.RBDs 发生交叉反应。
实验结果显示，接种疫苗前的血浆对 AAV.RBDv2 的转导没有抑制作用，而接种疫苗后的血浆则能有效中和 AAV.RBDv2（图 5B - D ）。从图 5B 中不同稀释度血浆处理后 AAV2.RBDv2 转导细胞的荧光图像，到图 5D 中量化数据计算出的 IC50 值，可以清晰地看到血浆中和能力的变化。点杂交实验也表明，人体抗体能与所有 AAV.RBDs 变体发生交叉反应，但不与野生型 AAV 结合（图 5E ），这进一步证实了 AAV.RBDs 在人体中的免疫反应特性。
图 5：Affinity and neutralization capacity of human anti-SARS-CoV antibodies on AAV.RBD variants
研究人员还分析了接种 Comirnaty 疫苗个体的外周血单个核细胞（PBMCs）在 AAV.RBDs 刺激后的细胞因子和趋化因子分泌情况。结果发现，AAV.RBDs 刺激后，T 细胞特异性细胞因子（如 IL-13、IL-17、IFN-γ ）、调节性细胞因子 IL-10 以及单核细胞来源的炎性细胞因子和趋化因子（如 IL-6）的分泌均有所增加（图 6A - C ）。同时，AAV.RBDs 刺激还促进了淋巴细胞的增殖，尤其是 B 细胞、辅助性 T 细胞、细胞毒性 T 细胞和 CD56dim NK 细胞群体（图 7 ）。这些结果表明，AAV.RBDs 能够在人体中引发先天性和适应性免疫反应的协同激活。
图 6：In vitro cytokine responses of human PBMC to AAV2 WT and AAV.RBD variants；
图7：Proliferation of activated PBMC populations in response to AAV2 WT and AAV.RBD variants
此外，研究人员用 AAV2.RBDv2 刺激接种过疫苗且感染过新冠病毒的个体的 PBMCs，发现能诱导出针对 SARS-CoV-2 RBD 抗原的强烈特异性 T 细胞反应，且没有对 AAV2 病毒蛋白的交叉反应（图 8A - C ）。这表明 AAV2.RBDv2 VLPs 能够有效激发针对目标抗原的 T 细胞反应，且具有高度的特异性，为 AAV.RBDs 作为疫苗候选物提供了重要的依据。
图 8：Memory-specific T cell response against SARS-CoV-2 after AAV2.RBDv2 pulsing
六、未来展望：AAV 载体疫苗的无限可能
AAV 载体疫苗的研究为疫苗研发带来了新的曙光。这种新型疫苗平台能够呈现大的免疫原性序列，引发针对插入抗原的强烈特异性免疫反应，同时对载体 AAV 衣壳的反应较弱，安全性较高。与传统疫苗和其他新型疫苗技术相比，AAV 载体疫苗具有独特的优势，如良好的稳定性、较低的免疫原性等。在未来，AAV 载体疫苗有望成为应对各种传染病的有力武器，尤其在那些传统免疫方法效果不佳的疾病领域，具有广阔的应用前景。
然而，目前 AAV.RBDs 在生产过程中还存在一些问题，如包装效率较低等，这需要进一步优化生产工艺来提高产量。此外，虽然 AAV.RBDs 在实验中展现出了良好的免疫原性和安全性，但要真正成为获批上市的疫苗，还需要进行更多的临床试验，充分评估其在人体中的长期安全性和有效性。相信随着研究的不断深入和技术的不断进步，AAV 载体疫苗将为全球公共卫生事业做出重要贡献。
识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入
