细胞需要精确地控制蛋白质水平以维持其稳态并响应环境变化
【1】
。蛋白质降解是这一过程的关键机制，它通过将泛素标记到蛋白质上并随后将其降解来实现。泛素-蛋白酶体系统
（UPS）
是执行这一任务的细胞机器，其中E3泛素连接酶扮演着至关重要的角色
【2】
。E3泛素连接酶负责选择性地将泛素添加到特定底物蛋白上，从而启动其降解过程。目前已知的E3泛素连接酶种类繁多，超过600种
【3】
。然而，大多数E3泛素连接酶的底物蛋白仍然未知，这限制了我们对UPS在细胞内功能的理解。虽然已有一些方法用于识别 E3 泛素连接酶的底物，例如全局蛋白质稳定性
（GPS）
分析，但这些方法存在局限性。GPS分析依赖于广泛抑制UPS功能的单一扰动，例如表达主导性负性CUL1片段或药物抑制蛋白酶体途径。这种单一扰动缺乏特异性，无法确定单个CUL1亚基对底物降解的贡献。此外，由于E3泛素连接酶和潜在底物数量庞大，GPS分析的规模也受到限制。
近日，来自美国华盛顿大学分子和细胞生物学系的
Jay Shendure
和
Chase C. Suiter
研究团队在
Molecular Cell
杂志发表题为
Combinatorial mapping of E3 ubiquitin ligases to their target substrates
的研究论文，该研究
开发了一种名为COMET的组合筛选方法，用于大规模识别蛋白酶体E3泛素连接酶与其靶蛋白之间的相互作用。
首先研究人员开发了一种名为COMET的方法。为了验证COMET方法的有效性，研究人员首先将其应用于SCF泛素连接酶，该酶介导靶蛋白的降解。他们
构建了一个包含6716个 F-box蛋白与潜在靶蛋白ORF组合的COMET库，并使用CRISPR-Cas9技术将库整合到 HEK293-rtTA-Cas9或K562-rtTA-Cas9细胞中
。通过比较每个ORF在含有非靶向gRNA和靶向gRNA的细胞池中的平均丰度，研究人员可以确定哪些E3泛素连接酶的敲除会影响特定靶蛋白的丰度。结果发现，许多E3-靶蛋白组合的
蛋白质丰度指数
（
PSI
）
显著增加，表明E3泛素连接酶的敲除稳定了这些靶蛋白。
为了进一步验证COMET方法的普适性，研究人员将其应用于降解寿命短的转录因子。他们构建了一个包含83,484个gRNA-ORF组合的 COMET 库，靶向241个编码CRL家族和 APC/C泛素连接酶亚基的基因，并将其整合到K562-Cas9-rtTA细胞中。同样地，研究人员发现，与 SCF 实验类似，许多E3-靶蛋白组合的PSI显著增加，表明E3泛素连接酶的敲除稳定了这些靶蛋白。
为了进一步理解E3-靶蛋白相互作用的特征，研究人员将所有实验中识别的E3-靶蛋白组合进行了分类。他们排除了涉及核心E3 蛋白成分的组合，并仅考虑显著稳定组合。结果表明，E3-靶蛋白相互作用可以分为四种类型：一对一、多对一、一对多和多对多。例如，FBXW7 蛋白调节了18个靶蛋白，包括 TP53，而TP53本身也受单个连接酶的调节，因此 FBXW7 与TP53之间的相互作用被归类为多对一。尽管研究人员并未测试所有E3蛋白与所有潜在靶蛋白之间的相互作用，但这些结果表明COMET方法可以揭示蛋白酶体调节网络的连接性。
为了验证COMET方法识别的E3-靶蛋白相互作用的可靠性，研究人员利用 AlphaFold-Multimer进行了计算机模拟。他们选择了103个显著稳定的COMET-靶蛋白组合，以及1000个来自COMET实验的非显著E3-靶蛋白组合作为对照组。此外，他们还选择了 1000个随机选择的蛋白质对作为随机对照，以及1000个来自BioPlex数据库的E3-蛋白质对作为阳性对照。通过计算每个模型的预测质量指标，研究人员发现COMET-靶蛋白组合与 BioPlex组合具有相似的置信度和一致性，并且显著高于随机对照和真实随机对照。这表明 AlphaFold-Multimer可以作为实验筛选的补充手段，为 E3-靶蛋白相互作用提供可靠的支持。
为了进一步研究AlphaFold-Multimer预测的E3-靶蛋白相互作用的特征，研究人员对一些显著稳定的组合进行了更详细的分析。他们使用AlphaFold对PTTG1、SOX12、CDKN1A和 APBB1IP蛋白进行了结构建模，并与其相应的E3 泛素连接酶共折叠。结果表明，共折叠可以增加与潜在降解结构域
（degron）
相对应的区域的模型置信度。例如，PTTG1蛋白的 KEN-box和 D-box模式在共折叠后具有更高的置信度，而SOX12蛋白的潜在降解结构域也与其转录激活结构域重叠。这些结果表明，AlphaFold-Multimer可以帮助识别 E3-靶蛋白相互作用中的潜在降解结构域。
图1 COMET技术揭示E3泛素连接酶与底物相互作用
总之，该研究
开发了COMET，一种大规模识别蛋白酶体E3泛素连接酶与靶蛋白相互作用的组合实验框架，并发现了许多复杂的E3-靶蛋白关系和具有结构基础的相互作用。
这项研究为理解蛋白酶体调节网络提供了新的见解，并为开发针对特定蛋白降解的疗法提供了新的靶点。
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.01.016
制版人：十一
1. King, R.W., Deshaies, R.J., Peters, J.M., and Kirschner, M.W. (1996). How proteolysis drives the cell cycle.
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Nat. Struct. Mol. Biol.
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Annu. Rev. Biochem.
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