Plus深读 | NGR靶向递送凝固酶至肿瘤血管阻止癌细胞生长

原文链接：

http://www.nature.com/articles/s41388-018-0213-4

对于大多数肿瘤而言，靶向递送凝固蛋白介导的肿瘤栓塞是一种极具吸引力和性价比的抗癌策略。早在1997年，研究发现删减的组织因子与不同的肿瘤内皮细胞标志物抗体组成的融合蛋白可诱导血栓形成 ¹ 。随后发现，这些融合蛋白在不同动物肿瘤模型中能够靶向诱导新生血管栓塞 ^2-4 。迄今为止，tTF-NGR是具有这一特性的唯一药物，已处于临床I期实验 ² ，全身注射1~4 mg/m ² 的tTF-NGR蛋白在癌症晚期病人中耐受性良好，并选择性抑制肿瘤灌注，但由于其诱导血栓不完全和副作用限制了其临床应用。本文研究工作者为寻找肿瘤栓塞治疗的有效药物，构建了凝固酶-NGR融合蛋白（tCoa-NGR），首先通过电脑分析和模拟其结构及与凝血酶原的相互作用，接着通过体内体外实验评估了其对肿瘤血管栓塞的作用和可能存在的副作用，最终发现tCoa-NGR能通过结合CD13和α _v β ₃ 整合素靶向识别肿瘤新生血管内皮细胞介导肿瘤血管栓塞，进而诱导肿瘤细胞死亡和抑制细胞增殖，可作为一种很有前景的抗肿瘤药物。

一、知识积累及缩略词

1. NGR motif： NGR序列能识别和结合肿瘤内皮细胞的CD13，经过脱酰胺基后形成Iso-DGR，通过识别α _v β ₃ 整合素靶向肿瘤新生血管。CD13和αvβ ₃ 整合素参与调控血管形成，在实体瘤的内皮细胞中高表达，促进肿瘤血管化和迁移。有意思的是，CD13和α _v β ₃ 整合素仅表达于新生血管，而不存在已有的内皮细胞和大多数成人的器官。

   
   

2. 葡萄球菌凝固酶（staphylocoagulase） ： 以下简称凝固酶，是由致病性革兰氏阳性菌 Staphylococcus 家族的成员产生，能刺激人体凝血系统，其N端的六肽段（Ilu1-Tyr6）介导凝血酶原（prothrombin）识别，通过改变构象激活酶原，而C端的5~8个串联的约27个氨基酸的肽段则识别纤维蛋白原（fibrinogen），通过与凝血酶（thrombin）结合进而剪切纤维蛋白原形成纤维蛋白（fibrin），从而介导血液凝固，详见图1A。

   
   

3. 组织因子（tissue factor，TF） ： 广泛表达于各种组织，是凝血过程的启动者，激活VII因子，进而激活X因子，然后活化凝血酶，最终活化纤维蛋白，形成凝血，详见图 1A。

   
   

4. tCoa-NGR作用机制： 如图1所示，实体瘤组织主要有高度增殖的细胞、静置的细胞和坏死的细胞组成，在tCoa-NGR注射后，靶向识别表达CD13和 α _v β ₃ 整合素的血管内皮细胞，结合凝血酶原形成复合体tCoa-NGR- prothrombin，激活纤维蛋白原，产生纤维蛋白，形成血栓，导致肿瘤饲养血管闭塞，氧气、能量和营养物质供给不足，无氧酵解进一步促进细胞坏死，从而阻止肿瘤生长。

   
   

5. 不同的Marker：

   ①CC3：cleaved caspase 3，检测细胞凋亡；

   ②Ki67：检测细胞增殖；

   ③CD13：标记新生血管内皮细胞；

   ④AST：aspartate aminotransferase，即谷草转氨酶，主要存在心肌细胞，其次是肝脏等组织，正常时血清含量低，当细胞损伤时，细胞膜通透性增加，释放进入血液中，用来评估肝脏损伤；

   ⑤ALT：alanine aminotransferase，即谷丙转氨酶，存在于各种细胞中，尤以肝细胞为主，正常时血液中含量很低，当少量肝脏细胞坏死后，血液中含量显著增加，是急性肝细胞损害的敏感标志；

   ⑥ALP：alkaline phosphatase，即碱性磷酸酶，广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，可用于评估肝脏损伤。

   ⑦creatinine：肌酐，肌肉在体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外，检测血肌酐评估肾功能；

   ⑧urea：尿素，哺乳动物蛋白质分解代谢的终产物，在肝脏通过鸟氨酸循环合成，主要由肾脏排泄，血尿素浓度用于评估肾脏功能。

   
   

6. 关键缩略词：

   ①tCoa：truncated coagulase，删减的凝固酶，仍具有酶的活性；

   ②NGR：GNGRAHA，负责识别肿瘤内皮细胞的CD13；

   ③tTF：truncated form of tissue factor，删减的组织因子，具有酶活性；

   ④Iso-DGR：NGR脱酰胺基后形成的新的识别结构，靶向识别 α _v β ₃ 整合素；

   ⑤FACS：fluorescence-activated cell sorting，荧光激活细胞分选术，分选特定细胞。

图1 tCoa-NGR和tTF-NGR凝血作用机制

二、材料和方法

1. 细胞系

   （1）4T1：鼠乳腺癌细胞；（2）PC3：人前列腺癌细胞；（3）HUVEC：人静脉内皮细胞；

   
   

2. 实验方法

   （1）生物信息学：用于分析和模拟蛋白分子的构象及相互作用，详情查阅原文；

   （2）分子克隆：构建tCoa和tCoa-NGR融合蛋白，并纯化该蛋白；

   （3）凝血实验：体外评估tCoa-NGR凝血作用；

   （4）凝固酶活性实验：评估tCoa-NGR凝固酶活性；

   （5）ELISA：体外评估tCoa-NGR与CD13和 α _v β ₃ 的结合；

   （6）FACS：体外验证tCoa-NGR与CD13和 α _v β ₃ 的结合；

   
   

三、实验结果

1. 电脑模拟发现tCoa-NGR能识别凝血酶原

   在开展实验前，研究工作者分析了tCoa-NGR融合蛋白的构象以及其与凝血酶原的相互作用（如图2），图2a展示tCoa-NGR的结构，图2b展示的是tCoa-NGR蛋白的三维构象，由两个结构域，C端识别血管内皮细胞表面抗原CD13和 α _v β ₃ ，N端负责识别凝血酶原并激活，图2c展示tCoa-NGR-凝血酶原的复合体构象，凝血酶原落入tCoa-NGR口袋结构内，图2d展示了凝血酶原的Arg ⁷⁵ 与tCoa-NGR的Glu ²¹³ 和 Tyr ⁴⁸ 的相互作用，图2e展示凝血酶原的Lys ⁸¹ 和tCoa-NGR的Asn ²⁸² 的相互作用，图2f展示了整体凝血酶原与tCoa-NGR的相互作用。

   
   

   图2 tCoa-NGR蛋白分子动态研究

   通过上述分析，研究工作者初步确定了tCoa-NGR和凝血酶原的相互作用。

   
   

   

2. tCoa-NGR能激活凝血酶原诱导凝血并靶向结合内皮细胞受体

   研究工作者通过分子克隆分别纯化了tCoa和tCoa-NGR蛋白，首先通过凝血实验检测其凝固酶活性，与tCoa相比，tCoa-NGR与凝血酶原结合在更短时间内导致凝固（如图3a），接着通过ELISA评估His标记的tCoa-NGR对特异表达CD13和 α _v β ₃ 的HUVECs的结合，通过竞争结合实验发现，加入非His标记的tCoa-NGR蛋白后，其竞争结合CD13和 α _v β ₃ ，显著降低了His标记的tCoa-NGR结合的HUVECs（如图3b）。进一步研究发现，tCoa-NGR与内皮细胞的结合呈现剂量依赖性，且在0.8 nM结合效率最高（如图3c）。此外，研究工作者利用FITC分别标记tCoa和tCoa-NGR，通过FACS评估了tCoa-NGR与内皮细胞受体结合能力，如图3d所示，M1 marker确定没有结合蛋白的细胞，M2 marker确定结合蛋白的细胞，其中peak1代表tCoa，peak2代表tCoa-NGR，由此可知FITC标记tCoa-NGR与内皮细胞的结合效率约60%，而tCoa不结合内皮细胞。

   
   

   
   

   图3 体外评估tCoa-NGR的凝固酶活性和靶向结合能力

   通过上述实验，研究工作者证明了tCoa-NGR具有凝固酶活性，而且靶向识别内皮细胞。

   
   

3. tCoa-NGR蛋白在肿瘤动物模型中富集于肿瘤部位并通过诱导血栓抑制肿瘤生长

   为进一步研究tCoa-NGR的作用，研究工作者利用高表达CD13和 α _v β ₃ 的PC3细胞系构建肿瘤动物模型，分别通过尾静脉注射20μg的荧光标记的tCoa-NGR蛋白、tCoa蛋白，同时注射生理盐水作为对照组，结果如图4所示，对照组和注射tCoa蛋白实验组的裸鼠中未发现特异性富集，但注射tCoa-NGR蛋白实验组中，肿瘤部位FITC荧光强度很强，提示tCoa-NGR蛋白在体靶向富集于肿瘤部位。

   
   

   在此基础上，研究工作者在裸鼠皮下分别注射4T1和PC3癌细胞的构建了两种肿瘤动物模型，三天连续给予10μg的tCoa-NGR蛋白或者tCoa蛋白处理，同时生理盐水作为对照组，记录7天内肿瘤生长情况，结果如图5。图5a展示在PC3肿瘤生长第七天，与tCoa蛋白处理相比，tCoa-NGR蛋白处理组肉眼可见肿瘤出血，且体积小很多，这提示tCoa-NGR通过诱导血栓形成抑制肿瘤生长，与此一致的是，在4T1和PC3肿瘤动物模型中，在治疗3天后，与生理盐水组和tCoa蛋白处理组相比，tCoa-NGR显著抑制肿瘤生长（如图5b），HE染色可知在4T1和PC3肿瘤中，tCoa-NGR蛋白处理组存在明显的血管栓塞，而生理盐水组和tCoa蛋白处理组中的血管结构正常，Masson三色法染色法进一步确定栓塞存在新生血管内（如图5c）。

   
   

   
   

   图4 在体追踪荧光标记的tCoa-NGR蛋白

   
   

   为进一步探索tCoa-NGR蛋白抗肿瘤的分子机制，研究工作者通过免疫组化检测了PC3肿瘤中CC3、Ki67和CD13的表达水平，结果如图6，在对照组和tCoa-NGR蛋白处理组中，CD13表达都很高，提示在PC3肿瘤中存在较多新生血管；与对照组相比，tCoa-NGR蛋白处理组中CC3水平增加，Ki67水平降低，提示tCoa-NGR蛋白处理肿瘤后，能诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖。

   
   

   图5 在体评估tCoa-NGR蛋白治疗潜能

   
   

   
   

   图6 PC3肿瘤组织中CD13、Ki67和CC3表达检测

   
   

4. tCoa-NGR蛋白在体具有良好的耐受性且副作用较小

   为评估tCoa-NGR蛋白在体内的药物毒性/耐受性，研究工作者尾静脉单次注射100μg的tCoa-NGR蛋白，生理盐水组为对照组，通过肉眼观察异常出血、尾巴糜烂、意外死亡等症状，同时集合血清学检测和显微观察（HE染色），如图7a，全面评估tCoa-NGR蛋白的副作用。在注射一周后，所有小鼠都存活，没有明显的副作用。血清学检测ALT、AST、ALP和肌酐在对照组和tCoa-NGR蛋白处理组中基本无差异（如图7b和7c），但是尿素在tCoa-NGR蛋白处理后上调约1.5倍（如图7c），提示tCoa-NGR可能具有一定的肾脏毒性。HE染色显示，与正常组织相比，低剂量（10μg）和高剂量（100μg）的tCoa-NGR蛋白处理组小鼠的脾脏、脑、肺、肾脏、心脏和肝脏中没有明显的栓塞或者组织坏死。

   
   

   图7 小鼠体内tCoa-NGR的毒性及药物耐受性研究

   
   

四、总结和思考

血管生成和新生血管的形成是肿瘤细胞存活、生长和转移的前提，与肿瘤代谢密切相关 ⁵ 。一般情况下，肿瘤细胞常常深埋在肿瘤基质中，逃避化疗药物甚至免疫细胞攻击 ⁶ 。破坏肿瘤血管不仅抑制肿瘤转移，同时也能使免疫细胞和药物有效到达肿瘤部位 ⁷ 。因此，血管靶向药物能应用于几乎所有类型的肿瘤，特别是伴随较多新生血管的高度增殖特性和侵袭表型的肿瘤，依据作用原理可分为以下三大类：（1）抑制血管形成；（2）破坏肿瘤血管；（3）诱导肿瘤血管栓塞。本文研究工作者构建的tCoa-NGR蛋白属于第三类，是通过诱导肿瘤血管栓塞发挥抗癌作用，其优点和担忧整理如下：

1. 优点：

   （1）高效：低剂量tCoa-NGR蛋白就可在体诱导4T1和PC3肿瘤新生血管栓塞并抑制肿瘤生长；

   （2）特异：NGR通过结合CD13和 α _v β ₃ 靶向识别新生血管内皮细胞可特异诱导肿瘤血管栓塞，对已存在的血管内皮细胞没有作用；

   （3）经济实惠：与其他血管靶向药物相比较，tCoa-NGR蛋白成本相对较低；

   （4）副作用小且良好耐受性：低剂量和高剂量对非肿瘤组织的器官基本没有损害。

2. 担忧：

   （1）免疫原性：tCoa-NGR是非人源的蛋白，可能作为抗原发生变应性反应，尽管有报道称低剂量的自由凝固酶在人体内具有很好的耐受性 ⁸ ，但仍不能排除tCoa-NGR在人体内的耐受性，需进一步跟进临床试验进行评估；

   （2）不能有效诱导凝固：凝固酶介导的凝固需要一定量凝固酶分子的积累，而人体内低剂量使用tCoa-NGR能否有效促使肿瘤血管形成栓塞仍需临床试验评估。

本文研究工作者将细菌来源的凝固酶和NGR motif巧妙的联系起来，即构建tCoa-NGR融合蛋白，前者发挥凝血作用，后者靶向通过结合CD13和 α _v β ₃ 整合素靶向识别新生血管内皮细胞，从而介导肿瘤血管栓塞，这一发现为肿瘤治疗提供了新颖的策略，可用于实体瘤治疗，但是仍需进一步临床试验评估其有效性和安全性，期望将来可用于临床治疗，解决癌症治疗这一大难题。

参考文献

1. Huang, X. et al. Tumor infarction in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumor vasculature. Science 275 , 547-50 (1997).

2. Bieker, R. et al. Infarction of tumor vessels by NGR-peptide-directed targeting of tissue factor: experimental results and first-in-man experience. Blood 113 , 5019-27 (2009).

3. Hu, P. et al. Comparison of three different targeted tissue factor fusion proteins for inducing tumor vessel thrombosis. Cancer Res 63 , 5046-53 (2003).

4. Kessler, T. et al. Inhibition of tumor growth by RGD peptide-directed delivery of truncated tissue factor to the tumor vasculature. Clin Cancer Res 11 , 6317-24 (2005).

5. Kubota, Y. Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy. Keio J Med 61 , 47-56 (2012).

6. Jahanban-Esfahlan, R., de la Guardia, M., Ahmadi, D. & Yousefi, B. Modulating tumor hypoxia by nanomedicine for effective cancer therapy. J Cell Physiol 233 , 2019-2031 (2018).