脐带间充质干细胞通过调节IL-6延缓小鼠银屑病样皮损的研究

银屑病又称牛皮癣，是常见的一种由过度活化的免疫细胞介导的以表皮细胞过度增殖与异常分化为特征的炎症性皮肤病，欧美患病率为 1% ～ 3% ，我国 1984 年报告患病率为 0.123% ， 2008 年调查 6 个城市患病率为 0.47% ^{［ 1 ］} 。临床表现为红色丘疹或斑块覆有多层银白色鳞屑的皮损，全身均可发病。除了累及皮肤附属器官和黏膜，银屑病还会并发代谢综合征、心血管疾病（如心肌梗死、卒中、高血压）等多系统疾病 ^{［ 2 ］} 。银屑病是由多基因遗传、多环境因素刺激诱导的慢性复发性疾病，目前尚无完全根治的手段，采取适当的对症治疗可以控制症状。现代医学主要采取光疗、局部用药治疗、系统治疗或生物疗法，但仍存在不同程度的毒副作用、疗效差、易复发、价格昂贵等问题。脐带间充质干细胞（ UC-MSCs ）通过直接的物理接触，以及最为重要的旁分泌作用产生多种生长因子、黏附分子、趋化因子等，募集、动员或抑制 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞直至整个免疫系统，在治疗皮肤炎症相关疾病中起关键作用 ^{［ 3-4 ］} 。本研究通过咪喹莫特（ IMQ ）乳膏涂抹建立银屑病样小鼠模型，探讨 MSCs 对银屑病的整体和局部治疗效果，为其临床应用提供试验依据。

1 材料

1.1 动物

6 周龄健康成年 C57BL6 小鼠 20 只， SFP 级，初始体质量 20 g 左右，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号 SCXK （京） 2011-0029 。

1.2 主要试剂

咪喹莫特乳膏（批号 17010139 ），购自四川明欣药业有限责任公司；伊红染色液（批号 20170515 ）、苏木素染色液（批号 20170201 ），购自北京中杉金桥生物技术有限公司； Mouse 白细胞介素（ IL ） -6 ELISA Kit （批号 20670614 ），购自 MultiSciences 公司。人源脐带间充质干细胞（ hUC-MSCs ），由天津长和生物技术有限公司 GMP 实验室生产制备。脐带供者已签署用于科学研究的捐献知情同意书，经传染病检测合格。采集的脐带组织经剪切后进行爬片分离，经传代扩增后制备成 2 × 10 ⁷ cells/mL 生理盐水细胞悬液，批号为 M2017051101 、 M2017051801 ，经无菌、支原体、内毒素、流式表型等质检合格后用于本实验。

2 方法

2.1 小鼠银屑病模型的建立 ^{［ 5 ］}

C57BL6 小鼠 ip 戊巴比妥钠（ 80 mg/kg ）麻醉，刮除其背部毛发，形成约 3 cm × 4 cm 大小的暴露区域，单笼饲养 1d 后按组别分别给予药物处理。全部小鼠随机分为对照组、模型组和 hUC-MSCs 组，对照组 6 只，模型组和 hUC-MSCs 组各 7 只。对照组每日定时在小鼠裸露背部涂抹适量凡士林，模型组和 hUC-MSCs 组每日定时在小鼠裸露背部涂抹 5% IMQ 乳膏 62.5 mg 。在开始涂抹前 1 d （ 0 d ）和涂抹后的第 6 天，对照组和模型组 sc200 μL 的生理盐水， hUC-MSCs 组每只小鼠 sc 2 × 10 ⁶ 个 hUC-MSCs ^{［ 6 ］} 。

2.2 小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度观察及评分

每日拍摄并记录各组小鼠银屑病样皮损面积形态，依据银屑病样皮损面积和疾病严重指数（ PASI ）评分 ^{［ 7 ］} 标准，给予小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润增厚程度 0 ～ 4 的积分，将 3 者积分相加定义为总积分，即得到 PASI 评分。对各小鼠 PASI 评分绘制皮损积分趋势线，观察小鼠皮损的变化情况。

2.3 HE 染色

各组小鼠在造模第 6 、 12 天取材，经脱颈处死，在每只小鼠背部相同部位剪取皮损处组织，固定于 10% 多聚甲醛溶液中制备石蜡切片，进行 HE 染色。显微镜观察 HE 染色后的切片，采用 NIS-Elements F 软件，在相同的曝光时间下记录切片的染色情况。将拍摄的照片导入 ImageJ 软件，利用测量工具，随机检测表皮 5 个不同部位的厚度，并计算平均厚度。

2.4 血清 IL-6 ELISA 检测

在持续涂抹 IMQ 乳膏的第 6 、 12 天，分别对每组 3 只小鼠采用摘眼球方法取血，并用干净的 EP 管收集血液，置于室温 1 h 后， 4 000 r/min 离心 15 min ，取上清，即得到血清样本，按 ELISA 试剂盒说明书进行 IL-6 含量检测。

3 结果

3.1 hUC-MSCs 对银屑病样小鼠模型皮损形成的影响

模型组和 hUC-MSCs 组在涂抹 IMQ 乳膏 1 d 后皮肤即可观察到红斑。随后，模型组的皮肤红斑快速出现，第 3 天后红斑已经非常明显，而 hUC-MSCs 注射组背部红斑在第 4 天达到较严重程度。两组的皮肤红斑在第 7 天开始逐渐消退。

模型组小鼠皮肤在涂抹 IMQ 乳膏后第 2 天出现细微鳞屑，第 3 天逐渐增多，成片、成层，在第 5 天最严重，随后逐渐缓解，在第 8 天开始只有细小的鳞片。 hUC-MSCs 组的鳞屑出现时间较模型组晚，但是在第 5 、 6 天的时候也达到了严重状态，随后也开始缓解。

模型组小鼠皮损处的皮肤增厚也是在涂抹 IMQ 乳膏后第 2 天出现开始，增厚逐渐明显，在第 5 天的时候，皮肤隆起极为明显。在第 7 天后开始逐渐缓解，但是隆起仍然明显。 hUC-MSCs 组皮肤变厚的时间较模型组晚 1 d 出现，在涂抹 IMQ 乳膏后的 6 d 内，增厚程度都低于模型组。在第 9 天后，皮肤增厚的情况明显缓解。

通过 PASI 积分趋势图可见， hUC-MSCs 能延缓皮损出现，同时减缓皮损严重程度，加快皮损部分的恢复。皮损部分观察及 PASI 积分见图 1 。

3.2 小鼠皮损组织学改变

在持续涂抹 IMQ 乳膏 6 d 后，发现模型组和 hUC-MSCs 组的表皮都显著增厚，模型组的角质层出现角化不全，真皮层增生和炎性细胞浸润现象明显，并伴有红细胞外溢，类似银屑病样皮损组织学表现。与对照组比较，模型组小鼠表皮厚度显著增加（ P ＜ 0.001 ）；与模型组比较， hUC-MSCs 组小鼠角化不全的细胞明显减少，表皮层厚度显著低于模型组（ P ＜ 0.01 ）。在持续涂抹 IMQ 乳膏 12 d 后，模型组和 hUC-MSCs 组的小鼠皮肤厚度较第 6 天都有所恢复，两组表皮厚度没有显著差异，但模型组真皮增生，炎性细胞浸润等现象仍较 hUC-MSCs 组明显。结果见图 2 。

3.3 小鼠血清 IL-6 水平检测

目前认为银屑病是由 T 淋巴细胞产生的一系列细胞因子共同作用引起的， IL-6 是一个具有多种潜能的细胞因子，可能作为角质形成细胞的生长因子，银屑病表皮的过度增生可能部分是由于 IL-6 的过度产生导致的 ^{［ 8 ］} 。正常血清样本中 IL-6 的浓度低而不能检测，在 IMQ 乳膏处理第 12 天的模型组中， IL-6 含量能被检测，平均质量浓度为 90.96 pg/mL ，而同期的 hUC-MSCs 组不能检测出。结果表明 hUC-MSCs 可能通过调节 IL-6 发挥免疫调节作用。见图 3 。

4 讨论

IMQ 是构建皮炎模型常用的药物，作为 Toll 样受体激动药，其与表皮浆细胞样树突状细胞及巨噬细胞内的 TLR7 结合，分泌大量的干扰素 α 以及多种白细胞介素致动物表皮角化过度、角化不全、棘层肥厚、血管生成和炎症细胞浸润等组织病理学改变 ^{［ 9 ］} ，持续用 IMQ 乳膏涂抹小鼠裸露皮肤 6 ～ 8 d ，小鼠皮肤出现红斑、鳞屑、增厚现象，类似银屑病样皮损，即为造模成功 ^［