HPLC指纹图谱结合化学模式识别评价舒筋活血制剂的整体质量

舒筋活血制剂是由香附、伸筋草、红花、香加皮等 10 味中药组成的复方制剂，具有活血散瘀、舒筋活络之功效 ^[1] ，主要用于治疗筋骨疼痛、跌打损伤、类风湿关节炎等症，临床数据显示效果良好。目前，针对舒筋活血制剂的文献报道以统计和观察临床数据为主 ^[2-6] ，化学成分和物质基础方面的研究非常薄弱，且现行的部颁质量标准存在一定的不足，主要原因是该品种组方复杂，成分多样，单一的定量指标难以满足其质量控制的要求。而指纹图谱是一种有效控制多组分复杂样品质量的方法，能够体现中药复方制剂的整体性特征 ^[7-8] 。近年来，指纹图谱结合模式识别方法已广泛应用于中药材的质量控制、来源分析及差异标志物筛选等方面，能有效弥补现有质量控制方法的不足 ^[9-14] 。本研究建立舒筋活血胶囊的指纹图谱，对 23 批舒筋活血制剂进行相似度评价并结合主成分分析（ PCA ）、聚类分析（ CA ）和正交偏最小二乘判别分析（ OPLS-DA ）等化学模式识别方法，筛选出差异性较大的质量标志物，建议在生产过程中对其重点关注，以实现对舒筋活血制剂的科学、系统的质量控制 ^[15-17] 。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 Infinity II 高效液相色谱仪，美国 Agilent Technologies 公司； YP502N 电子天平，上海菁海仪器有限公司； LD4-2A 离心机，北京京立离心机有限公司； PS-40A 超声波清洗机，深圳市深华泰超声清洗设备有限公司； HH-4 电热恒温水槽，常州澳华仪器有限公司；玻璃夹套加热装置，自制。

1.2 试剂

4- 甲氧基水杨醛对照品，批号 110790-201605 ，质量分数 99.74% ，购自中国食品药品检定研究院；对照品羟基红花黄色素 A （批号 17082905 ，质量分数 99.88% ）、迷迭香酸（批号 17040532 ，质量分数 99.40% ），购自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈，色谱纯，美国 Tedia 公司；甲酸，色谱纯，成都科隆化学试剂有限公司；纯净水，杭州娃哈哈有限公司。

1.3 药材

收集杭州华东医药集团康润制药有限公司 2016 — 2018 年生产的 16 批舒筋活血胶囊样品，编号为 S1 ～ S16 ，批号依次为 170104 、 161106 、 170101 、 160909 、 170207 、 170606 、 180111 、 180201 、 180402 、 181214 、 181215 、 181216 、 181217 、 181218 、 181219 、 181220 。另外样品分别来自江西红星药业有限公司舒筋活血胶囊（编号 S17 ，批号 J190103 ）、湖南安邦制药有限公司舒筋活血胶囊（编号 S18 ，批号 180402 ）、三门峡广宇生物制药有限公司舒筋活血片（编号 S19 ，批号 180317 ）、洛阳君山制药有限公司舒筋活血片（编号 S20 ，批号 181102 ）、河南金鸿堂制药有限公司舒筋活血片（编号 S21 ，批号 20180408 ）、洛阳顺势药业有限公司舒筋活血片（编号 S22 ，批号 20180707 ）、四川绵阳药业集团公司舒筋活血片（编号 S23 ，批号 1712012 ）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

1260 Infinity II 高效液相色谱仪；色谱柱为 Agilent Poroshell 120SB-C ₁₈ （ 150 mm × 4.6 mm ， 2.7 μm ），流动相为 0.2% 甲酸水溶液 - 乙腈，梯度洗脱： 0 ～ 15 min ， 5% ～ 15% 乙腈； 15 ～ 20 min ， 15% ～ 17% 乙腈； 20 ～ 25 min ， 17% ～ 20% 乙腈； 25 ～ 40 min ， 20% ～ 30% 乙腈； 40 ～ 50 min ， 30% ～ 35% 乙腈； 50 ～ 60 min ， 35% ～ 60% 乙腈； 60 ～ 65 min ， 60% ～ 100% 乙腈； 65 ～ 75 min ， 100% 乙腈；体积流量 0.5 mL/min ；检测波长 277 nm ；柱温 30 ℃；进样量为 10 μL ；所有组分理论塔板数不低于 4 000 。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取舒筋活血胶囊粉末（片剂研磨成细粉） 0.5 g ， 70% 甲醇 50 mL ，密塞，称定质量，水浴回流 1 h ， 3 000 r/min 离心 15 min ，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，取上清液， 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取羟基红花黄色素 A 、迷迭香酸、 4- 甲氧基水杨醛对照品适量，加 70% 甲醇溶解，制成含羟基红花黄色素 A 30 μg/mL 、迷迭香酸 37 μg/mL 、 4- 甲氧基水杨醛 25 μg/mL 的混合对照品溶液， 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批舒筋活血胶囊粉末（批号 180111 ），按“ 2.2 ”项方法制备供试品溶液，在“ 2.1 ”项色谱条件下连续进样 6 次进行分析，以 10 号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有峰的相对保留时间 RSD 均≤ 0.80% ，相对峰面积 RSD 均≤ 2.6% ，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批舒筋活血胶囊粉末（批号 180111 ），按“ 2.2 ”项方法制备供试品溶液，分别于制备后 0 、 2 、 4 、 8 、 12 、 24 h 在“ 2.1 ”项色谱条件下进样分析，以 10 号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有峰的相对保留时间 RSD 均≤ 1.53% ，相对峰面积 RSD 均≤ 3.67% ，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 按“ 2.2 ”项方法平行制备 6 份同一批次舒筋活血胶囊粉末（批号 180111 ）供试品溶液，在“ 2.1 ”项色谱条件下进样检测，以 10 号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有峰的相对保留时间 RSD 均≤ 4.15% ，相对峰面积 RSD 均≤ 0.78% ，表明该方法重复性良好。

2.5 舒筋活血制剂 HPLC 指纹图谱的建立

2.5.1 共有峰的标定及指认 取舒筋活血制剂，按“ 2.2 ”项方法制备 23 批供试品溶液，在“ 2.1 ”项色谱条件下进行样品和对照品溶液进样检测，记录色谱图。将各色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（ 2012 版）”，以样品 S1 作为参照图谱，利用多点校正法建立指纹图谱，中位数法生成 23 批样品的对照指纹图谱（ R ），见图 1 。根据生成的舒筋活血制剂指纹图谱结果，从图谱中选择分离度较好且含量较大的 10 个色谱峰作为共有特征峰，所选取的 10 个共有峰峰面积之和大于总峰面积的 90% 。经质谱指认出 7 个色谱峰， 其中 3 号峰为 5- 羟甲基糠醛（ [M ＋ H] ⁺ m / z 127.039 0 ， MS/MS m / z 109, 81, 53 ）， 4 号峰为黄柏内酯（ [M － H] ⁻ m / z 469.189 3 ， MS/MS m / z 423, 291, 195 ）， 5 号峰为羟基红花黄色素 A （ [M ＋ H] ⁺ m / z 613.179 9 ， MS/MS m / z 595, 451, 313, 211, 97 ）， 6 号峰为苯乙酸（ [M ＋ H] ⁺ m / z 137.059 9 ， MS/MS m / z 137, 93 ）， 8 号峰为去甲络石苷（ [M － H] ⁻ m / z 535.180 3 ， MS/MS m / z 373, 249, 123 ）， 9 号峰为迷迭香酸（ [M － H] ⁻ m / z 359.079 2 ， MS/MS m / z 161, 123 ）， 10 号峰为 4- 甲氧基水杨醛（ [M ＋ H] ⁺ m / z 153.054 2 ， MS/MS m / z 151, 92 ）。采用羟基红花黄色素 A 、迷迭香酸和 4- 甲氧基水杨醛 3 个对照品进行验证，其中 10 号峰（ 4- 甲氧基水杨醛）含量较大，分离度较好，故选择 10 号峰为参照峰，见图 2 。

2.5.2 相对保留时间和相对峰面积 分别计算 23 批舒筋活血制剂指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。实验结果见表 1 、 2 ， 23 批舒筋活血制剂中各共有峰相对保留时间的 RSD 为 0.75% ～ 2.64% ，表明所有批次中 10 个共有峰的出峰时间相对稳定。 23 批舒筋活血制剂中各共有峰相对峰面积的 RSD 为 26.31% ～ 81.35% ，表明 23 批来自不同厂家的舒筋活血制剂相对峰面积差异较大，且 3 号峰和 8 号峰的 RSD 值差异最大。

2.5.3 相似度计算 将 23 批舒筋活血制剂指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（ 2012 版），将 S1 设为参照图谱，生成对照指纹图谱（ R ），计算各批次样品与 R 之间的相似度，结果为 0.994 、 0.992 、 0.995 、 0.997 、 0.994 、 0.968 、 0.997 、 0.989 、 0.997 、 0.997 、 0.994 、 0.992 、 0.997 、 0.987 、 0.983 、 0.989 、 0.967 、 0.835 、 0.855 、 0.797 、 0.899 、 0.853 、 0.949 ，结果表明来自同一个厂家的 S1 ～ S16 ，相似度均大于 0.960 ；而来自 7 个不同厂家的 S17 ～ S23 ， S17 和 S23 相似度大于 0.949 ，剩余 4 批相似度为 0.797 ～ 0.899 ，表明不同厂家之间由于生产工艺和原料来源存在差异，导致相似度存在差异，同一厂家的样品相似度较为接近，质量的稳定性也较好。

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 PCA 对 23 批舒筋活血制剂进行 PCA ，以 10 个共有峰峰面积为变量，使用 SIMCA 13.0 统计软件选出贡献率最大的前 2 个主成分，前 2 个主成分的总贡献率为 80.48% ，即前 2 个主成分能反映舒筋活血制剂的基本特征。计算 23 批舒筋活血制剂的主成分得分， 23 批样品的主成分得分如图 3 所示。由图 3 可见， 23 批样品可以分为 3 类， S1 ～ S16 为一类； S23 和 S17 可以分为一类； S18 ～ S22 可以分为一类。同一厂家 16 批样品分为一类，不同厂家的 7 批样品中， S17 和 S23 可以分为一类，其余 4 批分为一类。结果表明 PCA 结果与相似度结果一致，杭州华东医药集团康润制药有限公司的 16 批舒筋活血胶囊制备工艺稳定， 江西红星药业有限公司 的舒筋活血胶囊和四川绵阳药业集团公司的舒筋活血片为一类，舒筋活血制剂的不同剂型并无太大差异。

图 4 为 23 批样品中 10 个指标的载荷图，主要 说明样品中 10 个原始变量与主成分 1 和主成分 2 的 相关程度，由图 4 可知，对主成分 1 影响最大的成分峰是峰 1 和峰 10 ，对主成分 2 影响最大的是峰 3 ，结果表明 10 个共有峰中，峰 1 、 3 、 10 能比较明显反映出样品的整体信息，其中 10 号峰经鉴定为 4- 甲氧基水杨醛，可以通过这 3 个色谱峰反映不同厂家和批次间的差异性。