王艳丽——“欲穷千里目，更上一层楼”(十)

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王艳丽

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http://www.ibp.cas.cn/ktzz/ktzz_W/201308/t20130829_3920466.html  

中国科学院生物物理研究，所研究员  国家杰出青年基金获得者  霍华德休斯医学研究所成员  

http://i.bio360.net/MEET/2018Genome/wyl.html

CRISPR–Cas mediated cleavage of invading nucleic acids  

Bacteria and archaea are protected against invading nucleic acids from phages and plasmids by their CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR associated proteins) systems, which are RNA-guided prokaryotic adaptive immune system. CRISPR-Cas systems are found in nearly half of all bacteria studied so far, as well as in the majority of archaea. However, throughout evolution, this host defense system has not resulted in the eradication of phages, suggesting that phages have evolved counter strategies to thrive within bacteria despite these mechanisms. Thus, both bacterial CRISPR system and phage anti-CRISPR system are part of a continuing evolutionary battle between bacterial host and their bacteriophage invaders. We revealed the molecular mechanism of how the CRISPR-Cas systems defend against the invading nucleic acids from the phages and plasmids by solving the structure of CRISPR effectors. Moreover, we also demonstrated that the anti-CRISPR protein 3 inhibit the CRISPR-Cas system through inhibiting recruitment of Cas3 by Csy complex.

Cell：解析Ⅵ型CRISPR-Cas系统C2c2-RNA复合物结构
Liang Liu; Xueyan Li; Jiuyu Wang; Min Wang; Peng Chen; Maolu Yin; Jiazhi Li; Gang Sheng; Yanli Wang *. Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities，Cell, 2017,168(1-2):121-134.

王艳丽课题组通过深入的研究，解析了C2c2与crRNA的二元复合物的晶体结构以及C2c2蛋白的晶体结构，揭示了C2c2包含一个crRNA识别的叶片即REC叶片，和一个核酸酶叶片即NUC叶片。REC叶片包含NTD结构域（N-terminal domain）和Helical-1结构域，NUC叶片包含了两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域。负责切割前体crRNA和靶标 RNA的活性口袋分别位于Helical-1和HEPN结构域上。crRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化，这种变化很可能会稳定crRNA的结合，进而对识别靶标RNA起着重要作用。该研究通过结构和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶标 RNA的分子机制，对认识细菌抵抗RNA病毒入侵的分子基础具有十分重要的意义。同时也为改造CRISPR-C2c2系统，为其在基因编辑领域的运用提供了强有力的结构基础，有助于加速对病毒感染引发的疾病的理解、治疗和预防。

Cell: 从结构上揭示Cas13a切割RNA机制
Liang Liu; Xueyan Li; Jun Ma3; Zongqiang Li; Lilan You; Jiuyu Wang; Min Wang; Xinzheng Zhang; Yanli Wang*. The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a, Cell, 2017. 170(4): 714-726.

王艳丽课题组和中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室创新课题组组长章新政课题组解析出来自口腔纤毛菌（Leptotrichia buccalis）的Cas13a （又称C2c2）（以下称LbuCas13a）结合到crRNA和它的靶RNA上时的晶体结构，以及LbuCas13a-crRNA复合物的冷冻电镜结构。他们证实 crRNA-靶RNA双链结合到LbuCas13a中的核酸酶叶（NUC）的带正电荷的中心通道内，并诱导LbuCas13a和crRNA发生构象变化，从而激活LbuCas13a的HEPN催化位点；被激活的LbuCas13a可以非特异性的切割任意的单链靶RNA。这些发现揭示出VI型CRISPR-Cas系统的Cas13a抵抗RNA噬菌体的作用机制，这就为将它作为一种RNA操纵工具加以应用铺平道路，如将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。

Molecular Cell：sgRNA的C2c1晶体结构揭示RNA介导的切割机制
Liu L, Chen P, Wang M, Li X, Wang J, Yin M, Wang Y. C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-guided DNA Cleavage Mechanism. Molecular Cell. 2017, 65.

在本研究中，课题组成员解析了结合有sgRNA的C2c1晶体结构。该结构显示C2c1由两个区域构成，分别是具有识别sgRNA功能的REC区域和具有核酸酶功能的NUC区域。sgRNA是由crRNA和tracrRNA人工嵌合而成，其中，crRNA结合在C2c1的中心孔道内，tracrRNA则被安置在C2c1外表面的凹槽中。有趣的是，通过进一步观察，课题组研究人员发现C2c1对应的sgRNA呈现出一种独特的结构。受到这个新结构的提示，研究人员一方面分析了其他物种的C2c1所对应的sgRNA结构，另一方面缩短了该sgRNA的长度，并进行活性实验，这两方面的结果都初步验证了这种独特结构的真实性和有效性。此外，该研究还发现目的序列的单个碱基突变可以显著降低C2c1剪切活性，这表明C2c1对靶定的目的序列有极其严格的要求，这一研究结果有助于开发新的基因组编辑工具，降低基因编辑过程中的脱靶现象。

Cell： 揭示CRISPR获取新间隔序列的分子机制
Wang, J., Li, J., Zhao, H., Sheng, G., Wang, M., Yin, M. & Wang, Y., Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas System. Cell. 2015, 163: 840-853.

王艳丽研究组通过深入的研究，解析了Cas1-Cas2与多种类型DNA的复合物的晶体结构，证明了被Cas1-Cas2所获取的外源核酸片段是以双叉的构象存在的, Cas1-Cas2复合物通过识别特定结构的DNA区分宿主自身以及外源入侵的核酸；Cas1-Cas2通过两个酪氨酸固定并且准确量取双链部分，并以序列特异性的方式识别3’单链的中PAM的互补序列（5’-CTT-3’），由Cas1发挥活性作用，分别在两端的3’ overhang切割出5nt的长度，产生了一段33nt长度的DNA片段；在这个过程中，与外源核酸片段的结合，使得Cas1-Cas2经历了类似于蝴蝶飞舞时“翅膀上扬”到“翅膀水平“的构象变化，最终通过一种类似切割-拷贝的方式将获取的外源核酸片段插入到了自身的CRISPR位点。该研究发现了Cas1-Cas2识别外源入侵DNA分子机制，揭示了外源核酸片段的长度是如何确定的，同时也解释了该阶段中的核心蛋白Cas1和Cas2各自的功能。因此，该成果为揭示原核生物这一新的抵御病毒及遗传物质的入侵的机制奠定了重要的理论基础。

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