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微生物所陈义华组/医科院药生所郭正彦组合作JACS：改造细胞色素P450酶选择性合成含不同类型吲哚骨架的环肽化合物

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2025-02-05 14:41

正文

▲共同第一作者：李超，马俊英

共同通讯作者：陈义华，郭正彦

通讯单位：中国科学院微生物研究所，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所

论文DOI： 10.1021/jacs.4c13535（点击文末「阅读原文」，直达链接）

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2025年1月16日，中国科学院微生物研究所陈义华研究员和中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所郭正彦研究员合作，在国际著名期刊《Journal of the American Chemical Society》上发表了题为“Selective Synthesis of Cyclopeptides with a 2-Oxindole or 3a-Hydroxy-hexahydropyrrolo-[2,3-b]indole Structure by Cytochrome P450 Enzymes”的研究论文。这项研究不仅发现了一类特殊功能的细胞色素P450酶——cpOPMOs，更为选择性合成含有3a-羟基六氢吡咯[2,3-b]吲哚（简称HO-HPI）或2-吲哚酮结构的环肽提供了一套重要的酶学工具箱（图1）。

图1. cpOPMOs选择性合成含有2-吲哚酮或HO-HPI结构的环肽化合物。

背景介绍

广泛分布于不同生物体中的含有2-吲哚酮或HO-HPI结构的生物碱表现出多种多样的生物活性，如抗细菌、抗真菌、抗肿瘤以及抗病毒等（图2A）。这些多样的结构和活性激发了研究人员对2-吲哚酮或HO-HPI结构形成酶的深入研究以及对高效生物催化剂的探索。目前，形成2-吲哚酮结构的酶主要包括黄素依赖的单加氧酶（FMO）、细胞色素P450单加氧酶以及特殊的双加氧酶，其中FMO的研究较为深入，基于晶体结构推测其可能通过环氧中间体形成2-吲哚酮结构。HO-HPI结构的形成主要依赖于FMO和P450酶，其中FMO的体外酶学已经被深入研究，但相关P450酶的体外研究尚未被报道。在课题组前期的研究工作中，已经成功鉴定了alboflavusin A₁ （AFN A₁）的生物合成基因簇，并通过体内实验初步推测P450酶基因afnD可能负责HO-HPI结构的形成（图2B；JACS 2018）。

图2. 含有 2-吲哚酮或HO-HPI结构的代表性天然产物。（A）来自不同生物体的含2-吲哚酮或HO-HPI结构的生物碱；（B）含有HO-HPI结构的环六肽化合物。

本文亮点

2-吲哚酮和HO-HPI结构是生物碱中重要的药效基团，因特殊的区域和立体选择性在有机合成化学中是一个长期挑战。本研究中，作者发现一类细胞色素P450酶AfnD及其同源蛋白HmtT、ClpD、KtzM和LtzR（统称为cpOPMOs），能够依赖pH值的调节将环肽中的色氨酸单元分别催化生成2-吲哚酮或HO-HPI结构。通过对这5个cpOPMOs的深入研究，推测两个保守的残基Asp和Ser（LtzR中为Thr）可能会以不同的方式打开环氧中间体，分别形成2-吲哚酮或HO-HPI结构。理解上述机制后，作者构建了10个cpOPMO的Asp或Ser/Thr突变体，它们可以选择性地合成具有HO-HPI或2-吲哚酮结构的环肽化合物，且所有10个cpOPMO突变体都表现出较高的底物不专一性，通常结构越接近于天然底物时，cpOPMO突变体活性越好。

图文解析

AfnD及其同源蛋白可以催化形成HO-HPI和2-吲哚酮结构

为了验证AfnD的功能，作者以pre-AFN A₁（12）为底物，发现P450酶AfnD可以催化底物12生成两种产物（图3A），即含有HO-HPI结构的AFN A₁（9）和含有2-吲哚酮结构的AFN C₁（13）。并且还观察到反应过程中pH值会影响两种产物的比例。在pH 6.0下，反应倾向于生成产物13，在pH 8.0下，反应则倾向于生成产物9（图3B和图3C）。

通过生物信息学分析发现AfnD与其同源蛋白HmtT、ClpD、KtzM和LtzR的序列一致性高达60%左右。以12为底物进行测试时，发现HmtT、ClpD、KtzM和LtzR均可以将其转化为9和13，且其反应过程中pH值影响的规律与AfnD类似，暗示这5个P450酶可能具有相似的催化机制。

图3. cpOPMOs的酶学研究。（A）不同cpOPMOs与底物12的活性测试；（B）不同pH值下AfnD与底物12的活性测定；（C）AfnD催化底物12生成产物9和13的反应过程。

HmtT通过两个关键残基介导HO-HPI和2-吲哚酮结构的形成

为深入探究cpOPMOs的催化机制，作者基于HmtT的晶体结构，利用分子对接搭建了HmtT-pre-AFN A₁的复合物模型，发现底物12沿着通道进入了活性位点，且色氨酸残基靠近heme，暗示反应适合发生（图4A和图4B）。在P450酶的催化过程中，推测I螺旋上一个保守的苏氨酸残基可能负责氧的激活。为验证这一假设，作者构建突变株HmtT T236A，发现两种产物的产量显著降低（图4C）。因此，当底物12进入活性区域后，可能会在残基T236和潜在水分子的辅助下，形成具有催化活性的中间体Compound Ⅰ（Cpd Ⅰ）。

随后，Cpd Ⅰ与底物12结合形成Cpd Ⅱ和吲哚环氧中间体。模型分析发现，残基S75和D73分别位于吲哚基团的两侧，可能参与环氧打开以及两个产物的形成过程。接着，作者又构建突变株HmtT D73A和S75A，测试发现在中性条件（pH 7.0）下，HmtT D73A主要生成产物为9，而HmtT S75A主要生成产物为13。基于以上结果，作者推测可能的催化机制，首先在吲哚环氧中间体形成后，S75的羟基和D73的羧基可能会竞争结合吲哚环氧化物。然后，在路径1中，S75的羟基通过氢键网络与环氧化物结合，促进C8a侧C-O键断裂，再在水分子的辅助下形成含有HO-HPI结构的产物9 。在路径2中，D73的羧基通过氢键与环氧化物结合，促进C3a侧C-O键断裂，再发生2,3-氢转移形成含有2-吲哚酮结构的产物13（图4D）。

图4. HmtT催化机制的推测。（A）HmtT与底物12的分子对接图；（B）HmtT与底物12的结合位点图；（C）HmtT及其突变体与底物12的比活力测定；（D）HmtT催化底物12生成产物9和13的机制推测。

5个cpOPMOs具有相似的催化机制

生物信息学分析显示，这5个cpOPMOs的3个关键残基（HmtT中对应的D73、S75和T236）具有较好的保守性。作者以HmtT为模板，使用AlphaFold2构建了AfnD、ClpD、KtzM和LtzR的结构模型。结构比对发现，这5个cpOPMOs的三维结构高度相似，均方根偏差（RMSD）小于1Å。蛋白AfnD、ClpD、KtzM和LtzR中I螺旋上保守的残基Thr与heme距离合适，推测其可能同样参与中间体Cpd Ⅰ的形成。接着将这4个P450酶分别与底物12进行分子对接，发现底物12均可以沿着通道进入活性位点，且两个保守的残基Asp和Ser（LtzR中为Thr）也分别位于吲哚基团的两侧，暗示它们可能与HmtT中的保守残基具有类似的功能（图5A）。

为研究AfnD的催化机制，作者构建了关键氨基酸残基突变株AfnD T237A、D74A以及S76A。酶活测定显示突变株AfnD T237A的催化效率显著下降，表明残基T237在AfnD的氧激活过程中起关键作用；突变株AfnD D74A主要生成产物9，而突变株AfnD S76A主要生成产物13，说明S76和D74 可能分别负责HO-HPI和2-吲哚酮结构的形成（图5B），证实前文的推测。另外，作者还分别构建了ClpD、KtzM以及LtzR的D73A和S75A（LtzR为T75A）突变体，发现与之前的结果类似，3个D73A突变体主要生成产物9，而2个S75A以及LtzR T75A突变体主要生成产物13，暗示这5个cpOPMOs具有相似的催化机制。

图5. AfnD、ClpD、KtzM和LtzR关键残基的点突变研究。（A）AfnD、ClpD、KtzM和LtzR与底物12的结合位点图；（B）AfnD、ClpD、KtzM、LtzR及其突变体与底物12的比活力测定。

选择性合成含有HO-HPI或2-吲哚酮结构的环肽化合物

考虑到cpOPMOs的催化生成产物与反应过程中的pH值直接相关，作者以12为底物，测试了10个cpOPMO的突变体的最佳反应条件。发现5个cpOPMO的Asp突变体在中性条件（pH 7.0）下倾向生成含有HO-HPI结构的环肽化合物，5个cpOPMO的Ser/Thr突变体在酸性条件（pH 6.0）下倾向生成含有2-吲哚酮结构的环肽化合物。

随后，作者研究了所有cpOPMO突变体催化的底物不专一性。以环六肽16-22作为底物进行测试，发现cpOPMO突变体均能识别这些环六肽底物并生成两种不同的产物，表现出较好的底物不专一性（图6）。其中，cpOPMO的Asp突变体主要生成含有HO-HPI结构的环六肽化合物，而Ser/Thr突变体主要生成含有2-吲哚酮结构的环六肽化合物。值得注意的是，当底物结构与天然底物越接近时，相关的cpOPMO突变体催化活性越强。另外，还发现部分突变体能够催化环五肽底物生成两种产物。因此，这些cpOPMO突变体可以作为一套高效的酶学工具箱用于合成各种含HO-HPI或2-吲哚酮结构的环肽化合物库。

图6. cpOPMO突变体的底物不专一性测试

本研究发现了一类细胞色素P450酶——cpOPMOs

微生物所陈义华组/医科院药生所郭正彦组合作JACS：改造细胞色素P450酶选择性合成含不同类型吲哚骨架的环肽化合物

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