酵母生产重组单克隆抗体：挑战与应对策略

抗体圈 · 公众号 · · 2025-03-07 10:58

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在生物医药领域，单克隆抗体（mAbs）可是明星分子。它是在实验室精心设计的蛋白质，就像一把把精准的 “钥匙”，能凭借着单亲和力或多亲和力，特异性地结合特定的目标或抗原，模拟人体免疫系统产生的天然抗体，对抗那些有害的病原体。而重组单克隆抗体则是通过在合适的宿主中克隆和表达合成抗体基因，在体外生产出来的，是生物制药中极为有效的一类药物。

酵母，作为众多宿主中的潜力股，在重组单克隆抗体制备方面有着独特的优势。然而，目前只有极少数酵母来源的单克隆抗体获得了监管机构的批准，能直接用于治疗。这背后是因为酵母在生产重组抗体时面临着不少挑战，同时在抗体结构、宿主工程以及培养策略等方面也有诸多需要考量的因素。接下来，我们就深入探讨一下这些问题。

一、重组单克隆抗体生产概述

重组抗体的生产，噬菌体展示技术是重要基础。在这个技术流程里，首先从供体 B 细胞中分离出免疫球蛋白（Ig）基因的 mRNA，接着制备成 cDNA，然后通过 PCR 技术扩增重链（HC）和轻链（LC）基因。M13 噬菌体是常用的一种，它会把 HC 和 LC 的 DNA 片段克隆到表达载体中，形成大量的 Fab DNA，再将这些质粒转染到大肠杆菌等微生物中。之后，含有 Fab DNA 的噬菌体与抗原进行孵育，这一步叫 “淘选”，能筛选出那些能特异性结合目标抗原的 Fab / 噬菌体。通过多次这样的筛选过程，就能得到针对特定抗原的 Fab / 噬菌体。

最初，大肠杆菌常被用作生产重组单克隆抗体的宿主，因为它操作简单。但抗体结构复杂，且大肠杆菌缺乏糖基化等重要的翻译后修饰能力，这对于生产人源化抗体来说是个很大的限制。虽然科研人员一直在努力，也成功在大肠杆菌中生产出了一些全长抗体和抗体片段，不过要想顺利生产出全长单克隆抗体，还是困难重重。

如今，哺乳动物细胞系是应用最广泛的表达系统，它能生产出功能完善的抗体。但使用哺乳动物细胞系成本较高，培养和下游处理也比较麻烦。因此，人们也在探索其他宿主，比如细菌、丝状真菌、酵母和昆虫细胞等，希望能降低生产成本。在这些宿主中，酵母逐渐崭露头角，它不仅能生产较短的抗体片段，还能生产全长抗体。

二、酵母作为重组单克隆抗体生产宿主

酵母相较于细菌，在重组抗体生产方面更具潜力。它具备先进的翻译后修饰、折叠和分泌机制，能够处理人源化全长抗体。而且，酵母基因操作简单，生长周期短，对培养基要求不高，最重要的是它不会释放内毒素，被认为是安全的（GRAS）生物体。像毕赤酵母（P. pastoris）、酿酒酵母（S. cerevisiae）、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）等多种酵母都在重组单克隆抗体制备中得到了应用。

1.毕赤酵母作为宿主

毕赤酵母在生产重组蛋白方面表现出色，它几乎不分泌内源性蛋白，这使得下游处理更加简便。它偏好呼吸生长，能在短时间内达到较高的细胞密度。毕赤酵母的一个显著特点是含有酒精氧化酶 1（AOX1）启动子，利用甲醇作为唯一碳源时，可诱导异源蛋白的表达。同时，连接来自酿酒酵母的 α - 交配因子（α - MF）信号肽和 KEX2 内切肽酶，能有效地将重组抗体分泌到培养基中。不过，如果使用较弱的甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAP）启动子进行细胞内表达，可能会导致蛋白质折叠缓慢，影响重链的正确折叠。

在实际生产中，研究人员已经在毕赤酵母中成功生产出多种重组抗体。例如，首次在毕赤酵母中生产出单克隆 scFv，产量达到 100mg/L；通过优化培养条件，还实现了全长人源化糖基化 IgG 产量达 1.4g/L，Fab 产量在不同启动子下也有不错的表现。

2.酿酒酵母作为宿主

酿酒酵母也是生产重组单克隆抗体的潜在宿主之一。早有研究在酿酒酵母中生产出小鼠 - 人嵌合抗体（全长 IgG）和 Fab 片段，不过产量相对较低。在酿酒酵母中，蛋白质折叠能力有限，高表达重组蛋白时，未折叠的蛋白会积累，引发未折叠蛋白反应（UPR）。通过操纵 UPR 基因，有望提高蛋白质折叠效率，增加重组抗体的产量。

3.其他酵母作为宿主

多形汉逊酵母作为一种甲基营养型酵母，也可用于生产重组蛋白。它的甲醇氧化酶启动子（MOX）、甲酸脱氢酶启动子（FMD）等可用于调控外源蛋白的表达。耶氏酵母（Y. lipolytica）和乳酸克鲁维酵母（K. lactis）能生产可溶性和活性 scFv，而粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）也有表达针对芳香染料荧光素的 scFv 的相关研究。

三、酵母生产单克隆抗体面临的挑战和注意事项

虽然酵母在重组单克隆抗体制备中有诸多优势，但也面临着不少挑战。

1.抗体异源表达带来的代谢负担

当酵母表达异源基因时，会干扰自身正常的代谢功能。这就好比给酵母细胞的 “生产线” 增加了额外的任务，导致细胞资源分配出现问题。比如，氨基酸等原材料和能量物质 ATP、GTP 等会优先供应给外源基因表达，从而影响细胞的生长，降低细胞的特定生长速率和最终生物量产量。研究发现，在生产重组抗体的酵母中，氨基酸和氧化还原代谢会发生明显变化，而外源基因的过表达诱导的 UPR 也是代谢负担产生的一个重要因素。不过，通过向培养基中添加氨基酸等策略，可以在一定程度上减轻代谢负担。

2.酵母糖基化工程

单克隆抗体的糖基化对其功能至关重要。N - 连接糖基化在抗体的 Fc 结构域和可变结构域都有发生，分别在免疫效应功能和抗原结合中发挥重要作用。酵母虽然能进行 N - 和 O - 连接糖基化，但它产生的聚糖结构与哺乳动物不同，缺乏一些关键的糖残基，如末端的 GalNAc、半乳糖、唾液酸和岩藻糖，还会出现高甘露糖化的情况，这可能导致免疫原性，影响重组抗体的功能。

为了解决这个问题，需要对酵母进行糖基化工程改造。通过删除 OCH1 基因阻止高甘露糖化，插入 α - 1,2 - 甘露糖苷酶、GnT1 等基因，构建类似人类的复杂聚糖结构。经过改造的毕赤酵母已能生产出具有均匀 N - 聚糖结构的功能性单克隆抗体，且产量可观。

3.重组单克隆抗体的溶解性和稳定性

蛋白质的溶解性是衡量其质量的重要指标，对于重组单克隆抗体也不例外。虽然酵母在这方面问题相对较少，但抗体的稳定性同样关键。不稳定的抗体可能会导致生产效率降低、疗效变差、引发患者的免疫反应，在储存和极端条件下也容易失去功能。

抗体中的二硫键对其折叠、稳定性和溶解性都很重要。在细菌中，由于细胞质的还原环境，抗体容易出现二硫键错误配对的问题。而在酵母中，发酵条件、蛋白酶分泌、储存温度等因素会影响抗体稳定性。通过基因工程手段，如在抗体中引入二硫键、共表达伴侣蛋白或进行化学修饰（如 PEG 化），可以提高抗体的稳定性。