Class 2 CRISPR：从基因编辑到靶点发现

前言

近些年，CRISPR-Cas系统频频登上“CNS”，其强大的基因编辑能力迅速让其从基础研究转化到临床试验。随着越来越多CRISPR-Cas家族成员的发现以及基础研究的进展，CRISPR的应用范围也越来越广。今天，小编就详细介绍下Class 2家族CRISPR的作用机制，以及它们在基因编辑，靶点发现，核酸   检测等多方面的进展。

CRISPR系统简介与分类

为了应对外来病毒和质粒的入侵，细菌和古生菌进化出了一套获得性免疫系统CRISPR-Cas。CRISPR-Cas系统主要包括由Cas基因组成的操纵子和CRISPR阵列，其中CRISPR由外来基因组靶标序列（spacers）和相同的重复序列（direct repeat）所构成。CRISPR-Cas系统发挥作用主要包括Adaptation，crRNA maturation以及Interference三个过程：首先在Cas1，Cas2等蛋白的作用下，将外来DNA序列组装到CRISPR阵列中，接着在系统外的RNase III或者系统自身效应蛋白的作用下，完成pre-crRNA的切割，最后效应蛋白在crRNA的引导下靶向目的DNA/RNA，从而发挥干扰作用。与Class 1 CRIPSR需要多个蛋白构成效应复合物不同，Class 2 CRISPR只需要单个效应蛋白。根据效应蛋白的不同，Class 2又可以进一步分为三个不同类型，分别是以Cas9为代表的Type II，以Cpf1为代表的的Type V和以C2c2为代表的的Type VI。

▲ CRIPSR-Cas 系统示意图

Class2 CRIPSR简介：Cas9，Cpf1与C2c2

CRISPR-Cas9是目前为止研究最深，应用最广的CRIPSR系统，它与后发现的Type V家族Cpf1都能够靶向目的dsDNA，但是两者相比有以下明显不同：1. Cpf1只需要一个crRNA完成目的序列的靶向，而Cas9中需要crRNA和tracrRNA两个分子来完成；2. Cpf1识别3’富含T的PAM序列，而Cas9识别5’富含G的PAM序列；3. 在Cas9中有HNH和RuvC两个活性结构域分别切割目标DNA的互补链和非互补链，而在Cpf1中一个全新的活性结构域Nuc，和RuvC分别切割目标DNA的互补链和非互补链；4. Cas9在PAM临近的位置切割DNA产生平末端，而Cpf1在PAM远端切割DNA产生突出的末端。而Type VI家族C2c2是一个RNA-guided的RNase，它含有两个HEPN结构域。在识别了目的RNA后，C2c2就变成了一个非特异的RNase，因此导致细胞毒性与程序性死亡。

▲ Class II CRISPR 分类

随着Cas9, Cpf1, C2c2的结构被解析，人们对于这些蛋白的机制和应用理解更深入。CRISPR技术引领了一波生物技术革新，由于其精确靶向性和易操作性，Cas9和Cpf1被广泛应用于基因编辑于基因治疗，而C2c2也能够用于基因沉默与核酸检测。这些技术将在下文向大家介绍。

▲ Cas9 ， Cpf1 与 C2c2 的特点

CRISPR 与基因编辑

虽然大部分 Class 2 CRISPR 蛋白在体外都具有切割活性，然而只有少数被证明能够用于哺乳动物细胞的编辑 。此外，由 PAM 带来的序列限制性， DNA 特异性带来的脱靶现象等，也是基因编辑中亟待解决的问题。

▲ 可用于哺乳 动物细胞基因编辑的 CRISPR 酶与其 PAM 序列

PAM 序列特异性的改造 。 以最常用的 SpCas9 为例，其 PAM 序列 NGG 在人类基因组上平均每 8-12bp 就会出现一次，这个频率基本能满足经典的 HDR 或者 NHEJ 为基础的基因编辑。然而对于一些需要单个核苷酸分辨率的情况，或者如 SaCas9 中， PAM 序列为 NNGRRT ，此时的 PAM 特异性就会成为一个重要的限制。为此，如何减少 PAM 的限制，扩展 Cas9 的靶向范围是非常具有意义的。

现在已有一些工作，通过突变Cas9蛋白的一两个氨基酸，从而改变其PAM的特异性。野生的FnCas9的PAM序列为NGG，而E1369R/E1449H/R1556A三突变RHAFnCas9则可将PAM序列放宽至YG。 通过细菌选择系统筛选得到的突变体VQRSpCsa9 (D1135V/R1335Q/T1337R) 可识别PAM为NGA和NGCG，EQR SpCas9(D1135E/R1335Q/T1337R)可以识别NGAG，VRERSpCas9 (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)可识别NGCG。

而在SaCas9中，突变体KKH（E782K/N968K/R1015H）能够将原PAM序列NNGRRT放宽到NNNRRT，而不增加SaCas9的脱靶频率。

▲ PAM 序列特异性的改造

降低脱靶效应 。 作为一种基因编辑工具，脱靶效应会产生大量副产物从而影响实验效率，因此如何降低脱靶效应也是值得不断探索的技术难题。有研究显示， Cpf1酶的特异性比Cas9高 ，因此使用CRISPR-Cpf1系统进行基因编辑可以降低脱靶效应。对于SpCas9及其他Cas9， 减少sgRNA与目的DNA的互补序列至20个bp以下 ，可以显著提高Cas9的特异性。减少Cas9蛋白在细胞中的存在时间也能够提高特异性，比如直接递送Cas9:sgRNA核苷酸蛋白复合物（RNPs）相比于质粒转染，产生的脱靶效应更少。此外使用改造的Cas9也能够特异性。比如 使用两个单活性结构域失活的nickase Cas9（Cas9n） ，分别靶向目的基因改造区域的两侧，这种方法能在保持on-target活性的基础上降低几个数量级的脱靶效应。或者 使用融合了非特异性限制内切酶FokI的失活Cas9（dCas9） ，FokI需要二聚才能发挥功能，当两个dCas9分别靶向目的基因改造区域的两侧，FokI才能在特定位点发生二聚从而切割DNA。此外， 使用内含肽失活的Cas9系统（intein-inactivatedCas9） ， 或者small-molecule-dimerizedsplit Cas9系统 ，能够控制有活性Cas9的产生，从而降低脱靶效应。最后通过Cas9中几个氨基酸的突变也能够提高DNA的特异性。 在spCas9中， HF Cas9(N497A/R661A/Q695A/Q926A)与eCas9(K848A/K1003A/R1060A)能够中和蛋白与DNA磷酸糖骨架之间的非特异性静电作用 ，从而显著提高Cas9对DNA的特异性。

▲ 提高 CRIPSR 系统 DNA 特异性的方法

精准编辑（ precise editing ） 。 由于同源依赖的修复 HDR 效率很低（ <5% ），大部分由 Cas9/Cpf1 产生的 DNA 双键断裂都由 NHEJ 修复完成，从而会引进许多随机的插入和缺失。此外， HDR 的效率还与细胞的类型与状态等因素相关，因此如何提高 HDR 效率从而完成基因的精准编辑也是 CRIPSR 技术用于临床的巨大挑战。

其中一个做法是 使用单个 Cas9n 与 donorDNA 底物 ，由于 DNA 缺口基本不会导致 NHEJ ，因此此方法只产生很少的插入和缺失， 但是其编辑效率与野生型相比显著下降，且能应用的细胞类型也十分有限 。由于 HDR 与 NHEJ 的竞争关系， 使用小分子的 NHEJ 抑制剂或者 HDR 的增强剂也能够提高 HDR 的发生频率 。 DNA ligase IV 的抑制剂 Scr7 ， DNA-PKcs 抑制剂，与 KU70/KU80 的抑制剂或者 Rad51 的小分子激活剂都能够提高 HDR 介导的基因编辑频率。此外， 将细胞同步在 G-phase 也能够提高 HDR 频率 。但是这些小分子抑制剂可能会影响细胞正常的功能，因此在实际使用中会有诸多限制。

同时在同源 DNA 模板上也能做一些改进。由于切割完成后， Cas9 从 DNA 上的解离是不对称的。若同源模板 DNA 能与最先被释放出的 DNA 退火的话， HDR 介导的基因编辑效率就会提高。为了避免完成编辑的 DNA 再次被 Cas9 识别切割， 可以通过突变同源模板 DNA ，使得 HDR 产物形成突变的 PAM 。

碱基编辑（ baseediting ） 是一种引入点突变的新策略，它不依赖于 HDR 或者 DNA 双键断裂。其主要方法是融合失活的 Cas9 （ dCas9 ）与一个胞嘧啶脱氨酶，在 dCas9 ， sgRNA 和目的 DNA 互补链形成三元复合物时，胞嘧啶脱氨酶能催化非互补链（单链）上的 C （互补序列 3-5 个碱基位置处）转化为 U ，接着引发细胞错配修复从而将原先的 C:G 替换为 T:A 。这种方法的编辑效率比 HDR 介导的点突变更高，且插入缺失突变更少。但是仍存在一些不足：首先需要被编辑的 C 距离 PAM 序列特定的位置，限制了广泛应用；其次可能无法分辨编辑窗口中的多个 C ，从而特异性降低。

▲ 提高精准基因编辑效率的办法

CRISPRa 与 CRISPRi 。 CRIPSR 除了用于精准编辑某个基因，还能用于调控基因的表达。当将转录激活结构域 VP64 与 dCas9:sgRNA 融合，就能够激活特定基因的表达。第二代 dCas9-activator 融合蛋白使用了多个拷贝的 VP16 ，三元激活因子 VPR （ VP64-p65-Rta ）或者串联重复的 VP64 表位标签肽段。此外，转录激活因子 MS2-p65-HSF1 等也可以通过结合 sgRNA 上的 RNA 发卡结构从而实现基因的转录激活。同时使用 dCas9-VP64 与 MS2-p65-HSF1 ，被称为协同激活调控（ synergistic activation mediator(SAM) ），展现出了超强的转录激活能力。相反的，失活的 Cas9 （ dCas9 ）本身或者 dCas9 融合转录抑制因子 KRAB 能够抑制特定基因的表达。而且，上文提到过的 small-molecule-activateddCas9 融合 VP64 或 KRAB ，就能够实现特定基因时空特异地激活与抑制。

除了直接融合转录激活 / 抑制因子， dCas9 还可以融合相关的表观遗传因子。如 dCas9 融合甲基转移酶 DNMT3A 使目标 DNA 区域 100bp 范围内甲基化水平升高；而 dCas9 融合去甲基化酶 Tet1 能使目标 DNA 200bp 范围内发生去甲基化。 dCas9 与 H3K27 乙酰化酶 p300 或者组蛋白去甲基化酶 LSD1 的融合，能够影响目的区域近千 bp 的组蛋白修饰变化，从而实现基因的转录调控。

▲ CRISPR 介导的基因转录激活与抑制

基因编辑试剂的递送（ delivery ）。 由于相关的基因编辑试剂都是蛋白，核酸等大分子，不能够自发地进入细胞内。此外，在血液中裸露的核酸还会被核酸酶降解从而引发免疫反应。因此基因编辑试剂如何能克服这些障碍，从而进入细胞核发挥作用是实现体内基因编辑的一大难题。

目前用于体内基因编辑递送主要有以下方法： 高压注射法（ Hydrodynamicinjection ,HDI ），脂质 - 纳米颗粒递送（ Lipidnanoparticle delivery ， LNP ）以及依赖病毒载体的递送（ Viraldelivery ） 。在老鼠乙肝病毒模型中， HDI 递送的 Cas9 和 sgRNA 质粒能够有效的降低乙肝病毒的表达量，但是在人临床实验中， HDI 的应用被其毒性和低转换效率所限制。利用 Lipid nanoparticle ，可以将纯化好的 Cas9:sgRNA 核苷酸蛋白复合物（ RNP ）递送到细胞内。与递送 mRNA 或者 DNA 质粒相比，递送 RNPs 中 Cas9 蛋白发挥活性的时间窗口更短，从而提高特异性，降低脱靶发生的频率。目前有多项利用 LNP 技术进行的基因编辑产品正在开发之中。

▲ 用于体内基因编辑的方法

曾在 90 年代用于基因治疗的病毒载体主要存在两个问题，一是质粒被整合到了基因组中错误的位置，导致了致癌基因的激活；而是因为病毒载体存在的高免疫原性，引发了宿主强烈的免疫反应，导致多器官功能衰竭与脑死亡。经过了近 20 年的改进，现在的病毒载体显示出更高的转化效率与更好的安全性质。现在主要使用的病毒载体包括 慢病毒（ lentivirus ），腺病毒（ adenovirus ）和腺相关病毒（ adeno-associatedvirus, AAV ） 。慢病毒是逆转录病毒的一种，它能够将病毒 DNA 整合到不分裂的细胞中。为了避免错误整合而导致的致癌基因激活，整合酶缺陷的慢病毒载体（ Integrase-defectivelentiviral vectors, IDLVs ）也被开发出来。慢病毒能够包装多达 8.5 kb 的 DNA ，足够满足 Cas9 ， sgRNA 和其他调控元件的包装。腺病毒能够感染分裂和不分裂期的细胞，而不整合进基因组。 然而腺病毒有很高的免疫原性可能会引发很强的免疫反应 。腺相关病毒来自细小病毒家族，是目前发现的一类结构最简单的单链 DNA 缺陷型病毒。 AAV 也能够感染分裂和不分裂期的细胞，而不整合进基因组；同时由于 AAV 在人体中广泛存在，所以其免疫原性也非常低。 此外，由于 AAV 有多种血清型，它可以用于器官特异性的递送 。 AAV 载体所面临的最大问题是它的包装限制为 4.5kb ，而最常用的 SpCas9 的大小为 4.2 kb ，几乎不可能将基因编辑的所有原件组装进一个载体。改进方法之一是使用更小的 Cas9 ，如 SaCas9 大小为 3.2 kb 。另一个方法是使用两个 AAV 载体分别包装一半 split-intein Cas9 ，当两个 AAV 载体共转时能形成完整功能的 Cas9 从而进行基因编辑。由宾夕法尼亚大学发明的 AAV2.0 技术授权给了 REGENXBIO 进行商业化开发，目前超过 70% 的临床 AAV 项目都采用了此平台。

▲ 慢病毒，腺病毒与腺相关病毒的特点

CRIPSR 相关公司 。小编之前的文章《 基因编辑能走多远： CRISPR 引领的精准医疗 》中已经详细介绍了张锋创办的 Editas Medicine ； Jennifer Doudna 的 Intellia Therapeutics 和 Emmanuelle Charpentier 等人联合创办的药物研发公司 CRISPR Therapeutics 。其中 Intellia Therapeutics 主要使用的递送方法是 LNP ，而 Editas Medicine 同时使用了 LNP 和 AVV 两种方法。在中国，华西医院率先开展世界首个 CRISPR 临床试验。试验采用 ex vivo 的方法，利用 CRISPR 技术敲除患者 T 细胞中的 PD-1 ，用于治疗用于治疗非小细胞肺癌。这次临床试验主要是为了检测这项疗法的安全性，希望能早日看到该实验的进展。

CRISPR 与靶点发现

CRIPSR/Cas9 除了直接用于基因编辑，也能够用于药物靶点的大规模筛选。现有的 shRNA 文库筛选存在两个缺点：一是 RNAi 不能够做到完全 knockdown ，因此会有很多假阴性；二是 RNAi 脱靶频率高，会导致很多的假阳性。 CRISPR 技术可以减少这些干扰，同时由于 sgRNA 序列一般比较短，可以实现高通量的 array-based 寡核苷酸合成，从而构建 sgRNA 文库。 CRISPRi LOF （ loss-of-function ）文库与 CRISPRa GOF （ gain-of-function ）文库都可以以细胞生长为指标，大规模地分析癌细胞中的遗传依赖关系。此外，在加入某药品的情况下进行筛选，可以分析该药物产生耐药性的机制。比如在黑色素瘤细胞系 A375 中进行 BRAF 抑制剂 vemurafenib 的耐药性筛选发现，肿瘤抑制因子 NF2 ， culin E3 连接酶 CUL3 以及一些组蛋白乙酰转移酶 STAGA 复合物成员的缺失，会导致 vemurafenib 耐药性产生。

▲ 利用 CRISPRi 和 CRISPRa 进行高通量的药物靶点筛选

同样的， CRISPR 也能够用于最近异常火爆的“协同致死（ synthetic lethality ）”基因的筛选。最近《 Nature Methods 》上发表了 Trey Ideker 和 Prashant Mali 教授的工作，他们利用 CRISPR 技术，在 HeLa ， A549 和 293T 三个细胞系中，发现 73 个癌基因与药物靶点之间，存在着 152 对协同致死效应组合。其中包括 28 对也被证实的组合，如 BRCA1-PARP1 和 PTEN-MTOR 。通过药物进一步确认，这个结果的准确精确性在 75% 以上，因此能用于大规模筛选协同致死基因。 Dual-gRNA 文库是通过 array-based 寡核苷酸合成建立的，涵盖了 10 万多组基因组合。因此每个构建包含两个 gRNA ，靶向两个目的基因，根据其对细胞生长的影响从而判断两个基因之间的遗传关系。在所有的 152 对组合中只有 16 组（ 10.5% ）是其中两个细胞系共有的，而且不存在三个细胞系共有的组合。这说明了协同致死效应存在着细胞特异性。

▲ CRISPR 方法筛选协同致死基因组合

C2c2 与与核酸检测

Type VI 家族的 C2c2 于 2016 年被报道，与 Cas9 和 Cpf1 切割双链 DNA 不同， C2c2 是一个 RNA-guided 的 ssRNA 切割酶。当时作者提出 C2c2 可以用于核酸检测，在今年 4 月的《 Science 》上，张峰课题组带来了 C2c2 的重磅应用，用于检测核酸，其灵敏度可达到阿摩尔级（ aM, 10 的负 18 次方摩尔每升），甚至有望检测出单个核酸，这对于某些诊断的应用有着重要意义。为了得到更为灵敏的信号，选择了 RNase 活性更强的 LwC2c2 。同时为了进一步提高检测灵敏度，也使用了“等温扩增”（ isothermal amplification ）技术。待检 DNA 经重组聚合酶（ recombinase polymeraseamplification, RPA ）扩增后再经 T7 转录为 RNA ，当 LwC2c2 识别这 RNA 后，就可以发挥非特异的 RNase 活性，从而将系统里添加的 RNA 荧光探针切开，释放出荧光。此方法的灵敏度达到了单分子级别，且能够用于癌症液体活检等。由于这套系统中的成分都可以采用冻干粉的方法保存，有利于实现这套系统的商业化。

▲ C2c2 用于核酸检测示意图

争议！ CRISPR 的脱靶效应

虽然上文已经介绍过多种方法用于降低 CRISPR 的脱靶效应，但是今年 5 月《 Nature Methods 》上发表了一篇论文，文章发现在在小鼠的体内实验中， CRISPR 技术会引入数百种意料外的基因突变。研究者们对两只接受了 CRISPR 基因编辑的小鼠和一直未接受编辑的小鼠进行了全基因组测序，结果发现两只小鼠中都出现了 100 多种插入 / 缺失突变，而对照组小鼠只有 3-4 种。令人诧异的是在两只小鼠中，有 68% 的突变是两者共有的，且这些突变的基因组序列与 sgRNA 序列之间的同源性并不高。这篇研究迅速成为了整个生物圈关注的热点，也有科学家对此结果提出了质疑。