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Class 2 CRISPR：从基因编辑到靶点发现

生物制药小编 · 公众号 · 药品 · 2017-06-28 07:35

正文

前言

近些年，CRISPR-Cas系统频频登上“CNS”，其强大的基因编辑能力迅速让其从基础研究转化到临床试验。随着越来越多CRISPR-Cas家族成员的发现以及基础研究的进展，CRISPR的应用范围也越来越广。今天，小编就详细介绍下Class 2家族CRISPR的作用机制，以及它们在基因编辑，靶点发现，核酸检测等多方面的进展。

CRISPR系统简介与分类

为了应对外来病毒和质粒的入侵，细菌和古生菌进化出了一套获得性免疫系统CRISPR-Cas。CRISPR-Cas系统主要包括由Cas基因组成的操纵子和CRISPR阵列，其中CRISPR由外来基因组靶标序列（spacers）和相同的重复序列（direct repeat）所构成。CRISPR-Cas系统发挥作用主要包括Adaptation，crRNA maturation以及Interference三个过程：首先在Cas1，Cas2等蛋白的作用下，将外来DNA序列组装到CRISPR阵列中，接着在系统外的RNase III或者系统自身效应蛋白的作用下，完成pre-crRNA的切割，最后效应蛋白在crRNA的引导下靶向目的DNA/RNA，从而发挥干扰作用。与Class 1 CRIPSR需要多个蛋白构成效应复合物不同，Class 2 CRISPR只需要单个效应蛋白。根据效应蛋白的不同，Class 2又可以进一步分为三个不同类型，分别是以Cas9为代表的Type II，以Cpf1为代表的的Type V和以C2c2为代表的的Type VI。

▲ CRIPSR-Cas系统示意图

Class2 CRIPSR简介：Cas9，Cpf1与C2c2

CRISPR-Cas9是目前为止研究最深，应用最广的CRIPSR系统，它与后发现的Type V家族Cpf1都能够靶向目的dsDNA，但是两者相比有以下明显不同：1. Cpf1只需要一个crRNA完成目的序列的靶向，而Cas9中需要crRNA和tracrRNA两个分子来完成；2. Cpf1识别3’富含T的PAM序列，而Cas9识别5’富含G的PAM序列；3. 在Cas9中有HNH和RuvC两个活性结构域分别切割目标DNA的互补链和非互补链，而在Cpf1中一个全新的活性结构域Nuc，和RuvC分别切割目标DNA的互补链和非互补链；4. Cas9在PAM临近的位置切割DNA产生平末端，而Cpf1在PAM远端切割DNA产生突出的末端。而Type VI家族C2c2是一个RNA-guided的RNase，它含有两个HEPN结构域。在识别了目的RNA后，C2c2就变成了一个非特异的RNase，因此导致细胞毒性与程序性死亡。

▲ Class II CRISPR分类

随着Cas9, Cpf1, C2c2的结构被解析，人们对于这些蛋白的机制和应用理解更深入。CRISPR技术引领了一波生物技术革新，由于其精确靶向性和易操作性，Cas9和Cpf1被广泛应用于基因编辑于基因治疗，而C2c2也能够用于基因沉默与核酸检测。这些技术将在下文向大家介绍。

▲ Cas9，Cpf1与C2c2的特点

CRISPR与基因编辑

虽然大部分Class 2 CRISPR蛋白在体外都具有切割活性，然而只有少数被证明能够用于哺乳动物细胞的编辑。此外，由PAM带来的序列限制性，DNA特异性带来的脱靶现象等，也是基因编辑中亟待解决的问题。

▲ 可用于哺乳动物细胞基因编辑的CRISPR酶与其PAM序列

PAM序列特异性的改造。以最常用的SpCas9为例，其PAM序列NGG在人类基因组上平均每8-12bp就会出现一次，这个频率基本能满足经典的HDR或者NHEJ为基础的基因编辑。然而对于一些需要单个核苷酸分辨率的情况，或者如SaCas9中，PAM序列为NNGRRT，此时的PAM特异性就会成为一个重要的限制。为此，如何减少PAM的限制，扩展Cas9的靶向范围是非常具有意义的。

现在已有一些工作，通过突变Cas9蛋白的一两个氨基酸，从而改变其PAM的特异性。野生的FnCas9的PAM序列为NGG，而E1369R/E1449H/R1556A三突变RHAFnCas9则可将PAM序列放宽至YG。通过细菌选择系统筛选得到的突变体VQRSpCsa9 (D1135V/R1335Q/T1337R) 可识别PAM为NGA和NGCG，EQR SpCas9(D1135E/R1335Q/T1337R)可以识别NGAG，VRERSpCas9 (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)可识别NGCG。

而在SaCas9中，突变体KKH（E782K/N968K/R1015H）能够将原PAM序列NNGRRT放宽到NNNRRT，而不增加SaCas9的脱靶频率。

▲ PAM序列特异性的改造

降低脱靶效应。作为一种基因编辑工具，脱靶效应会产生大量副产物从而影响实验效率，因此如何降低脱靶效应也是值得不断探索的技术难题。有研究显示，Cpf1酶的特异性比Cas9高，因此使用CRISPR-Cpf1系统进行基因编辑可以降低脱靶效应。对于SpCas9及其他Cas9，减少sgRNA与目的DNA的互补序列至20个bp以下，可以显著提高Cas9的特异性。减少Cas9蛋白在细胞中的存在时间也能够提高特异性，比如直接递送Cas9:sgRNA核苷酸蛋白复合物（RNPs）相比于质粒转染，产生的脱靶效应更少。此外使用改造的Cas9也能够特异性。比如使用两个单活性结构域失活的nickase Cas9（Cas9n），分别靶向目的基因改造区域的两侧，这种方法能在保持on-target活性的基础上降低几个数量级的脱靶效应。或者使用融合了非特异性限制内切酶FokI的失活Cas9（dCas9），FokI需要二聚才能发挥功能，当两个dCas9分别靶向目的基因改造区域的两侧，FokI才能在特定位点发生二聚从而切割DNA。此外，使用内含肽失活的Cas9系统（intein-inactivatedCas9），或者small-molecule-dimerizedsplit Cas9系统，能够控制有活性Cas9的产生，从而降低脱靶效应。最后通过Cas9中几个氨基酸的突变也能够提高DNA的特异性。在spCas9中，HF Cas9(N497A/R661A/Q695A/Q926A)与eCas9(K848A/K1003A/R1060A)能够中和蛋白与DNA磷酸糖骨架之间的非特异性静电作用，从而显著提高Cas9对DNA的特异性。

▲ 提高CRIPSR系统DNA特异性的方法

精准编辑（precise editing）。由于同源依赖的修复HDR效率很低（<5%），大部分由Cas9/Cpf1产生的DNA双键断裂都由NHEJ修复完成，从而会引进许多随机的插入和缺失。此外，HDR的效率还与细胞的类型与状态等因素相关，因此如何提高HDR效率从而完成基因的精准编辑也是CRIPSR技术用于临床的巨大挑战。

其中一个做法是使用单个Cas9n与donorDNA底物，由于DNA缺口基本不会导致NHEJ，因此此方法只产生很少的插入和缺失，但是其编辑效率与野生型相比显著下降，且能应用的细胞类型也十分有限。由于HDR与NHEJ的竞争关系，使用小分子的NHEJ抑制剂或者HDR的增强剂也能够提高HDR的发生频率。DNA ligase IV的抑制剂Scr7，DNA-PKcs抑制剂，与KU70/KU80的抑制剂或者Rad51的小分子激活剂都能够提高HDR介导的基因编辑频率。此外，将细胞同步在G-phase也能够提高HDR频率。但是这些小分子抑制剂可能会影响细胞正常的功能，因此在实际使用中会有诸多限制。

同时在同源DNA模板上也能做一些改进。由于切割完成后，Cas9从DNA上的解离是不对称的。若同源模板DNA能与最先被释放出的DNA退火的话，HDR介导的基因编辑效率就会提高。为了避免完成编辑的DNA再次被Cas9识别切割，可以通过突变同源模板DNA，使得HDR产物形成突变的PAM。

碱基编辑（baseediting）是一种引入点突变的新策略，它不依赖于HDR或者DNA双键断裂。其主要方法是融合失活的Cas9（dCas9）与一个胞嘧啶脱氨酶，在dCas9，sgRNA和目的DNA互补链形成三元复合物时，胞嘧啶脱氨酶能催化非互补链（单链）上的C（互补序列3-5个碱基位置处）转化为U，接着引发细胞错配修复从而将原先的C:G替换为T:A。这种方法的编辑效率比HDR介导的点突变更高，且插入缺失突变更少。但是仍存在一些不足：首先需要被编辑的C距离PAM序列特定的位置，限制了广泛应用；其次可能无法分辨编辑窗口中的多个C，从而特异性降低。

▲ 提高精准基因编辑效率的办法

CRISPRa与CRISPRi。CRIPSR除了用于精准编辑某个基因，还能用于调控基因的表达。当将转录激活结构域VP64与dCas9:sgRNA融合，就能够激活特定基因的表达。第二代dCas9-activator融合蛋白使用了多个拷贝的VP16，三元激活因子VPR（VP64-p65-Rta）或者串联重复的VP64表位标签肽段。此外，转录激活因子MS2-p65-HSF1等也可以通过结合sgRNA上的RNA发卡结构从而实现基因的转录激活。同时使用dCas9-VP64与MS2-p65-HSF1，被称为协同激活调控（synergistic activation mediator(SAM)），展现出了超强的转录激活能力。相反的，失活的Cas9（dCas9）本身或者dCas9融合转录抑制因子KRAB能够抑制特定基因的表达。而且，上文提到过的small-molecule-activateddCas9融合VP64或KRAB，就能够实现特定基因时空特异地激活与抑制。

除了直接融合转录激活/抑制因子，dCas9还可以融合相关的表观遗传因子。如dCas9融合甲基转移酶DNMT3A使目标DNA区域100bp范围内甲基化水平升高；而dCas9融合去甲基化酶Tet1能使目标DNA 200bp范围内发生去甲基化。dCas9与H3K27乙酰化酶p300或者组蛋白去甲基化酶LSD1的融合，能够影响目的区域近千bp的组蛋白修饰变化，从而实现基因的转录调控。

▲ CRISPR介导的基因转录激活与抑制

基因编辑试剂的递送（delivery）。由于相关的基因编辑试剂都是蛋白，核酸等大分子，不能够自发地进入细胞内。此外，在血液中裸露的核酸还会被核酸酶降解从而引发免疫反应。因此基因编辑试剂如何能克服这些障碍，从而进入细胞核发挥作用是实现体内基因编辑的一大难题。

目前用于体内基因编辑递送主要有以下方法：高压注射法（Hydrodynamicinjection ,HDI），脂质-纳米颗粒递送（Lipidnanoparticle delivery，LNP）以及依赖病毒载体的递送（Viraldelivery）。在老鼠乙肝病毒模型中，HDI递送的Cas9和sgRNA质粒能够有效的降低乙肝病毒的表达量，但是在人临床实验中，HDI的应用被其毒性和低转换效率所限制。利用Lipid nanoparticle，可以将纯化好的Cas9:sgRNA核苷酸蛋白复合物（RNP）递送到细胞内。与递送mRNA或者DNA质粒相比，递送RNPs中Cas9蛋白发挥活性的时间窗口更短，从而提高特异性，降低脱靶发生的频率。目前有多项利用LNP技术进行的基因编辑产品正在开发之中。

▲ 用于体内基因编辑的方法

曾在90年代用于基因治疗的病毒载体主要存在两个问题，一是质粒被整合到了基因组中错误的位置，导致了致癌基因的激活；而是因为病毒载体存在的高免疫原性，引发了宿主强烈的免疫反应，导致多器官功能衰竭与脑死亡。经过了近20年的改进，现在的病毒载体显示出更高的转化效率与更好的安全性质。现在主要使用的病毒载体包括慢病毒（lentivirus），腺病毒（adenovirus）和腺相关病毒（adeno-associatedvirus, AAV）。慢病毒是逆转录病毒的一种，它能够将病毒DNA整合到不分裂的细胞中。为了避免错误整合而导致的致癌基因激活，整合酶缺陷的慢病毒载体（Integrase-defectivelentiviral vectors, IDLVs）也被开发出来。慢病毒能够包装多达8.5 kb的DNA，足够满足Cas9，sgRNA和其他调控元件的包装。腺病毒能够感染分裂和不分裂期的细胞，而不整合进基因组。然而腺病毒有很高的免疫原性可能会引发很强的免疫反应。腺相关病毒来自细小病毒家族，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。AAV也能够感染分裂和不分裂期的细胞，而不整合进基因组；同时由于AAV在人体中广泛存在，所以其免疫原性也非常低。此外，由于AAV有多种血清型，它可以用于器官特异性的递送。AAV载体所面临的最大问题是它的包装限制为4.5kb，而最常用的SpCas9的大小为4.2 kb，几乎不可能将基因编辑的所有原件组装进一个载体。改进方法之一是使用更小的Cas9，如SaCas9大小为3.2 kb。另一个方法是使用两个AAV载体分别包装一半split-intein Cas9，当两个AAV载体共转时能形成完整功能的Cas9从而进行基因编辑。由宾夕法尼亚大学发明的AAV2.0技术授权给了REGENXBIO进行商业化开发，目前超过70%的临床AAV项目都采用了此平台。

▲ 慢病毒，腺病毒与腺相关病毒的特点

CRIPSR相关公司。小编之前的文章《基因编辑能走多远：CRISPR引领的精准医疗》中已经详细介绍了张锋创办的Editas Medicine；Jennifer Doudna的Intellia Therapeutics和Emmanuelle Charpentier等人联合创办的药物研发公司CRISPR Therapeutics。其中Intellia Therapeutics主要使用的递送方法是LNP，而Editas Medicine同时使用了LNP和AVV两种方法。在中国，华西医院率先开展世界首个CRISPR临床试验。试验采用ex vivo的方法，利用CRISPR技术敲除患者T细胞中的PD-1，用于治疗用于治疗非小细胞肺癌。这次临床试验主要是为了检测这项疗法的安全性，希望能早日看到该实验的进展。

CRISPR与靶点发现

CRIPSR/Cas9除了直接用于基因编辑，也能够用于药物靶点的大规模筛选。现有的shRNA文库筛选存在两个缺点：一是RNAi不能够做到完全knockdown，因此会有很多假阴性；二是RNAi脱靶频率高，会导致很多的假阳性。CRISPR技术可以减少这些干扰，同时由于sgRNA序列一般比较短，可以实现高通量的array-based寡核苷酸合成，从而构建sgRNA文库。CRISPRi LOF（loss-of-function）文库与CRISPRa GOF（gain-of-function）文库都可以以细胞生长为指标，大规模地分析癌细胞中的遗传依赖关系。此外，在加入某药品的情况下进行筛选，可以分析该药物产生耐药性的机制。比如在黑色素瘤细胞系A375中进行BRAF抑制剂vemurafenib的耐药性筛选发现，肿瘤抑制因子NF2，culin E3连接酶CUL3以及一些组蛋白乙酰转移酶STAGA复合物成员的缺失，会导致vemurafenib耐药性产生。

▲ 利用CRISPRi和CRISPRa进行高通量的药物靶点筛选

同样的，CRISPR也能够用于最近异常火爆的“协同致死（synthetic lethality）”基因的筛选。最近《Nature Methods》上发表了Trey Ideker和Prashant Mali教授的工作，他们利用CRISPR技术，在HeLa，A549和293T三个细胞系中，发现73个癌基因与药物靶点之间，存在着152对协同致死效应组合。其中包括28对也被证实的组合，如BRCA1-PARP1和PTEN-MTOR。通过药物进一步确认，这个结果的准确精确性在75%以上，因此能用于大规模筛选协同致死基因。Dual-gRNA文库是通过array-based寡核苷酸合成建立的，涵盖了10万多组基因组合。因此每个构建包含两个gRNA，靶向两个目的基因，根据其对细胞生长的影响从而判断两个基因之间的遗传关系。在所有的152对组合中只有16组（10.5%）是其中两个细胞系共有的，而且不存在三个细胞系共有的组合。这说明了协同致死效应存在着细胞特异性。

▲ CRISPR方法筛选协同致死基因组合

C2c2与与核酸检测

Type VI家族的C2c2于2016年被报道，与Cas9和Cpf1切割双链DNA不同，C2c2是一个RNA-guided的ssRNA切割酶。当时作者提出C2c2可以用于核酸检测，在今年4月的《Science》上，张峰课题组带来了C2c2的重磅应用，用于检测核酸，其灵敏度可达到阿摩尔级（aM, 10的负18次方摩尔每升），甚至有望检测出单个核酸，这对于某些诊断的应用有着重要意义。为了得到更为灵敏的信号，选择了RNase活性更强的LwC2c2。同时为了进一步提高检测灵敏度，也使用了“等温扩增”（isothermal amplification）技术。待检DNA经重组聚合酶（recombinase polymeraseamplification, RPA）扩增后再经T7转录为RNA，当LwC2c2识别这RNA后，就可以发挥非特异的RNase活性，从而将系统里添加的RNA荧光探针切开，释放出荧光。此方法的灵敏度达到了单分子级别，且能够用于癌症液体活检等。由于这套系统中的成分都可以采用冻干粉的方法保存，有利于实现这套系统的商业化。

▲ C2c2用于核酸检测示意图

争议！CRISPR的脱靶效应

虽然上文已经介绍过多种方法用于降低CRISPR的脱靶效应，但是今年5月《Nature Methods》上发表了一篇论文，文章发现在在小鼠的体内实验中，CRISPR技术会引入数百种意料外的基因突变。研究者们对两只接受了CRISPR基因编辑的小鼠和一直未接受编辑的小鼠进行了全基因组测序，结果发现两只小鼠中都出现了100多种插入/缺失突变，而对照组小鼠只有3-4种。令人诧异的是在两只小鼠中，有68%的突变是两者共有的，且这些突变的基因组序列与sgRNA序列之间的同源性并不高。这篇研究迅速成为了整个生物圈关注的热点，也有科学家对此结果提出了质疑。Editas Medicine的首席技术官Vic E. Myer与著名科学家GM Church联合发文，他们认为研究的数量非常有限，可能会限制观察统计的重现性和可靠性。此外作者不能排除实验动物和单个对照之间报告的基因组差异在CRISPR实验操作之前存在的可能性。

任何技术的发展总会遇到波折，希望这样的学术探讨能够促进对CRISPR技术特异性的理解，使得CRISPR药物早日进入市场，造福人类。

参考文献

CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes, Cell, 2017
CRISPR/Cas9:From Genome Engineering to Cancer Drug Discovery, Trends in Cancer, 2016
SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems, Cell, 2016
Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems,Science, 2016
Delivery technologies for genome editing, NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY, 2017
Combinatorial CRISPR–Cas9 screens for de novo mapping of genetic interactions, Nature Methods, 2017
Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 2017
CRISPR gene editing can cause hundreds of unintended mutations, Nature Methods, 2017