来源：青椒医学
自噬过程逐渐成为国家自然科学基金的热点话题，本期我们将以一个 2023 年成功中标的项目为例，详细解析申请书的撰写要点。接下来我们以一个中标项目为例展示如何撰写中药调控自噬的国自然标书。健脾止动汤：这是一种中医药方，通常用于治疗由脾虚引起的各种症状，如消化不良、疲劳等。在这个研究中，它被用来治疗多发性抽动症。多发性抽动症：这是一种以不自主、快速、突发性的肌肉抽动为特征的神经系统疾病。H3R：指组胺受体 3 型（Histamine Receptor Type 3），是一种 G 蛋白偶联受体，参与调控神经递质的释放。PI3K（磷脂酰肌醇 3 激酶）：这是一个信号传导通路中的关键酶，参与细胞增殖、生长、存活和代谢等多种生物过程。AKT（也称为蛋白激酶 B）：AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是 PI3K 通路下游的重要效应分子，影响细胞生存和增殖。自噬：自噬是细胞清除损坏细胞器、蛋白质和入侵微生物的过程，通过形成自噬体将它们送至溶酶体分解。小胶质细胞：小胶质细胞是中枢神经系统中的常见免疫细胞，参与神经系统的免疫防御和维持神经环境稳定。突触修剪：突触修剪是一个神经发育过程，通过这一过程，神经系统去除不必要或功能失常的突触连接，有助于神经网络的优化和成熟。在这个研究中，健脾止动汤可能通过影响 H3R 受体，进而激活 PI3K/AKT 通路和自噬过程，调控小胶质细胞的功能，最终影响突触的修剪和功能，从而治疗多发性抽动症。基于上述分析结果，本项目的思路大致为健脾止动汤激活 H3R-PI3K/AKT/自噬通路，抑制小胶质细胞中的过度突触修剪，从而减轻多发性抽动症的症状。（4）提出假设（根据研究热点和预实验数据，提出自己的科学假说，一句话）；（5）拟进行研究（研究内容的缩写，打算怎么证明或验证假设）；（6）研究意义。同时撰写时严格把控字符数，400 以内多发性抽动症严重影响患者的社会功能和生活质量，迫切需要新型治疗手段。当前对 H3R-PI3K/AKT/自噬通路在神经调节中的作用理解不足，其机制尚待明确。初步研究显示，健脾止动汤能激活该通路，抑制小胶质细胞中的过度突触修剪，推测其对多发性抽动症具有潜在治疗效果。我们已在神经元培养模型中观察到相应的信号通路改变，支持进一步探索。据此提出科学假设：健脾止动汤通过激活 H3R-PI3K/AKT/自噬通路，抑制小胶质细胞的过度突触修剪，减轻多发性抽动症症状。通过在组织样本水平、体内、体外和分子水平，借助免疫荧光染色、WB 和电生理记录等技术，明确健脾止动汤的功能作用，阐释其作用机制，评价其治疗多发性抽动症的应用潜力。此研究可能为多发性抽动症提供一种新的治疗策略，增进对神经退行性疾病调控机制的理解。
立项依据
立项依据的撰写主要包括几个部分：
国自然基金重在科学假说的创新性、合理性、明确性、逻辑性、科学性、完善性，缺一不可。但是点到为止，既要证明该假说的合理，又不能把所有的实验都做完，是一个拼图游戏，所以这里面分子机制的实验数据列举需要有个度，预实验达到总研究内容的 30% 左右为宜。
在撰写立项依据时，参考文献也需要注意以下几点：
- 引用最新的研究成果：近 3 年，不可引用太老的文章，且需引用几篇申请当年发表的文献；
- 引用适量的文献：在立项依据中，不要过度引用文献，也不要过于依赖文献堆砌，青年、地区 30 篇左右，面上 40 篇左右即可。
- 此外，一个好的小标题能让专家在短时间内更直观地明确你的内容，所以写好立项依据的小标题能给人留下好的第一印象，非常重要。标题的取法注意有逻辑、有层次，上下连贯，并阐明一个具体的结论而不是 xxx 的作用，xxx 的影响之类的科普性语句。
描述多发性抽动症对患者生活质量的影响及当前治疗的局限性，阐述开发新疗法的迫切性和潜在社会经济影响。综述健脾止动汤在传统医学中的应用背景和前期研究中观察到的临床效果，特别是对多发性抽动症症状的改善。1.3 健脾止动汤激活 H3R-PI3K/AKT 通路探讨健脾止动汤如何通过激活 H3R-PI3K/AKT 信号通路来发挥作用，包括相关生物标志物的变化和通路激活的初步分子证据。1.4 PI3K/AKT-自噬通路的激活抑制小胶质细胞突触修剪深入分析 PI3K/AKT 通路与自噬过程的相互作用，及其如何影响小胶质细胞的功能，尤其是突触修剪在多发性抽动症中的作用及其调控机制。明确阐述本研究的核心假说及其科学依据，概述后续实验设计、预期结果及如何验证这些假说的详细步骤，包括实验模型和使用的技术方法。研究目标
研究目标的撰写注意以下几点：
- 目标清晰，层次分明，只写目标，不用再重复研究意义、用什么方法研究，且目标具体，可实现。
- 可按照明确 …… 关系；揭示 …… 规律；理解 …… 作用；阐明 …… 机制等的模板撰写。
1. 明确健脾止动汤激活 H3R-PI3K/AKT 通路在多发性抽动症模型中的具体效应，评估其对症状减轻的直接影响及相关生物标志物的变化。2. 揭示 H3R-PI3K/AKT 通路与自噬过程之间的相互调控规律，以及这种相互作用如何影响小胶质细胞中突触修剪的生理和病理过程。3. 理解自噬通路在抑制小胶质细胞过度突触修剪中的作用机制，探索其对多发性抽动症治疗效果的贡献及潜在的临床应用价值。研究内容的撰写需注意是为了达成研究目标而要去做的研究，与研究目标呼应，为具体研究方案的框架，撰写过程中可按照临床样本、动物水平、细胞水平分层次撰写，阐明做什么事达成什么目的。同时明确细胞、动物模型的选择和构建。那么，该如何撰写呢？我们这里以图文的形式为大家展现（注意，这里的配图仅是为了大家直观地理解研究内容的写作，并非是技术路线图，实际的标书中研究内容部分并不需要该图）在临床试验中，我们选取 100 名多发性抽动症患者，随机分为两组：健脾止动汤治疗组和安慰剂对照组，每组 50 名。采集的临床样本包括血液和脑脊液。检测手段将包括免疫组化（IHC）以及 Western blot 分析，针对的分子标志物为 H3 受体（H3R）、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（AKT）及其下游效应蛋白，如 LC3 和 p62 以监测自噬流程。此外，还将使用 ELISA 技术检测血清中的炎症因子水平，如 TNF-α 和 IL-6。功能性磁共振成像（fMRI）评估大脑区域活动的变化，以了解药物对大脑功能的影响。脑电图（EEG）监测脑电活动的变化，通过认知和行为评估测试如 MMSE（简易精神状态检查）和 MoCA（蒙特利尔认知评估）来评估患者的认知功能和心理状态。动物模型将使用基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9）构建 H3R 敲除的转基因小鼠，以模拟多发性抽动症状态。小鼠将分为健脾止动汤处理组和对照组，每组 20 只。将采用行为学测试（如定位逃避测试和开放场测试）评估抽动症状。神经生物学检测将包括免疫组化和免疫荧光染色，检测小胶质细胞活性（Iba1 染色）、突触密度（synaptophysin 染色），以及 Western blot 和 qRT-PCR 评估自噬和突触修剪相关蛋白和 mRNA 的表达。选用小胶质细胞系 BV2 和 N9 进行体外实验，设置健脾止动汤处理组、对照组和 H3R 特异性抑制剂（JNJ-5207852）处理组以及健脾止动汤+PI3K 抑制的挽救实验组。检测手段包括：利用流式细胞术检测细胞凋亡和周期；使用免疫共沉淀（Co-IP）检测 H3R 与 PI3K 的相互作用；通过免疫荧光观察自噬体的形成（LC3 染色）；并通过 Western blot 和 qRT-PCR 评估突触修剪相关蛋白如 C1q、C3 的表达。在分子层面，将深入研究健脾止动汤如何通过激活 H3R-PI3K/AKT 通路影响自噬和突触修剪。此部分将采用高通量蛋白质组学和转录组学技术分析治疗前后蛋白和基因表达的全局变化，特别关注自噬和突触修剪相关标志物的动态变化。此外，采用质谱技术探索健脾止动汤中有效成分与靶蛋白的直接相互作用，揭示其分子机制。关键科学问题的撰写需要凝练出本项目的重点难点问题，同时与研究目标、研究内容相呼应，使得研究目标就是去解决这个问题，而研究内容就是解决这个问题的方式。撰写中在提出科学问题之后还要解释一下为什么这是关键科学问题；并给出解决方案，如何去解决这个问题。在青年、地区项目中，关键科学问题通常写 2 个即可，面上则撰写 3 个为宜。1. 明确健脾止动汤如何通过调控小胶质细胞的功能治疗多发性抽动症是本项目拟解决的关键科学问题之一。多发性抽动症涉及神经系统的复杂调控异常，小胶质细胞作为中枢神经系统的主要免疫细胞，在疾病状态下可能参与病理性突触修剪和神经炎症。健脾止动汤对这些细胞功能的调控作用是其潜在治疗效果的基础，了解其具体机制对于评估和优化治疗策略至关重要。本项目拟使用基因敲除或药物干预的多发性抽动症动物模型，实施免疫组织化学和免疫荧光染色来观察小胶质细胞在病理状态下的活性变化。同时，结合行为学测试评估健脾止动汤对症状的影响。此外，应用流式细胞术和 Western blot 分析小胶质细胞中炎症因子和突触相关蛋白的表达，从而揭示健脾止动汤调控小胶质细胞功能的分子基础。2. 阐明健脾止动汤激活 H3R-PI3K/AKT/自噬通路的分子机制是本项目拟解决的关键科学问题之二。研究表明 PI3K/AKT/自噬通路在多种神经疾病中具有重要作用，具体如何通过药物激活该通路以及其与 H3R 的相互作用仍需明确。健脾止动汤可能提供一种新的治疗策略，通过激活这一通路减轻多发性抽动症。本项目拟通过细胞培养实验，使用小胶质细胞和神经元共培养系统，结合药理学干预（H3R 拮抗剂和 PI3K 抑制剂）和基因敲除技术，研究健脾止动汤成分对 H3R-PI3K/AKT/自噬通路的直接影响。此外，利用实时 PCR 和蛋白质组学分析，详细描绘通路激活前后的分子变化。
2024 年度国自然医学部 50 大科研热点中标数统计如下：
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