准确和完整的转录是生命活动不可或缺的环节，然而多种内源和外源的DNA损伤可能阻挡RNA聚合酶，干扰正常转录。转录偶联修复（Transcription-Coupled Repair, TCR）是一种从细菌到人类都拥有的DNA修复机制，可以高效修复转录模板链上的损伤，从而保证转录的正常进行。TCR是1985年首先在哺乳动物细胞中发现的【1】，随后证明其是核苷酸切除修复的一条亚途径，利用被损伤阻挡的RNA聚合酶II（PolII）识别损伤并募集下游的通用修复因子完成修复。人类TCR相关基因的缺陷会引起科凯恩综合征（Cockayne syndrome, CS）和UV敏感综合征（UV-sensitive syndrome, UVSS）等遗传疾病。上世纪90年代，通过对CS的研究，鉴定了CSA和CSB两个TCR核心因子【2,3】；2012年第三个TCR核心因子UVSSA在对UVSS的研究中被发现【4-6】。然而，传统的遗传学手段无法研究个体水平上的必需基因，例如PolII及转录延伸复合物的其它组分。近年来，蛋白质组技术以及细胞层面的高通量遗传筛选揭示了PolII大亚基RPB1-K1268位点多聚泛素化【7,8】以及转录延伸因子ELOF1【9,10】在TCR中的关键作用。尽管经过近40年的研究，尤其是近年来取得了一系列重要进展，哺乳动物TCR反应依然无法在体外重构，下游修复因子招募的分子机制也未被完全阐明，提示可能还存在未知的TCR核心因子，这也是本领域最重要的科学问题。最近，来自多个国家的四个研究团队共同报道了一个新的TCR核心因子STK19。其中荷兰莱顿大学Martijn S. Luijsterburg领导的联合团队以及美国哈佛大学Johannes C. Walter领导的联合团队2024年11月14日在Cell杂志发表两篇背靠背的研究论文，荷兰伊拉斯姆斯大学Jurgen A. Marteijn带领的联合团队也于同日在Molecular Cell杂志发表研究论文，复旦大学胡晋川课题组稍早时候（10月2日）在Nucleic Acids Research杂志以Breakthrough Article形式发表研究论文。STK19（serine/threonine kinase 19，丝氨酸/苏氨酸激酶19）曾被认为是一个蛋白激酶，与NRAS驱动的黑色素瘤有关【11】，但后续研究发现它没有激酶活性【12】。2016年的一项多组学研究发现STK19与细胞的UV敏感性有关【13】，2020年另一项针对多种DNA损伤的大规模遗传筛选再次发现STK19与UV损伤等DNA加合物损伤的细胞敏感性有关（该研究同时也发现了ELOF1）【14】。然而，尚不清楚STK19是否参与了TCR，以及如果参与，它与已知的修复因子如何协同作用。Luijsterburg团队首先验证了STK19影响细胞对DNA加合物损伤的敏感性以及损伤后的转录恢复，随后通过检测TCR引起的链断裂与DNA合成证明STK19确实参与了TCR。在此基础上，通过UV照射后PolII免疫共沉淀发现STK19是TCR复合物的组成部分，但缺失STK19不影响其它TCR因子的招募，对下游修复因子的支架TFIIH的招募也只有较弱的影响。作者在今年早些时候报道的包含DNA、PolII、CSB、CSA-DDB1、UVSSA与ELOF1的TCR复合物结构【15】基础上，用冷冻电镜解析了包含STK19的TCR复合物结构，发现STK19与DNA、PolII大亚基RPB1、CSA以及UVSSA都存在相互作用，并通过突变STK19参与相互作用的残基验证了这些相互作用在TCR中都发挥了重要作用，免疫共沉淀也证明CSA缺失时STK19无法被招募到TCR复合物。根据STK19在TCR复合物中的位置，作者推测它参与TFIIH的定位，并通过AlphaFold预测STK19与TFIIH的亚基XPD存在相互作用。基于预测结果，将PolII-TCR复合物和包含TFIIH的下游复合物结构进行叠加，发现STK19可以帮助TFIIH准确定位。体外生化实验表明STK19可以促进TFIIH的解旋酶活性，且STK19与XPD相互作用位点的突变严重抑制了TCR活性。利用免疫共沉淀与TCR-seq等技术，发现STK19促进了在TCR过程中具有重要作用的UVSSA-K414单泛素化，以及PolII和TCR复合物从损伤位点解离，但并不影响RPB1-K1268多聚泛素化。总而言之，本研究发现STK19是一个新的TCR核心因子，与DNA和多个修复因子存在广泛的相互作用，通过帮助TFIIH定位和促进PolII清除在TCR过程中发挥关键作用。
Marteijn团队也通过类似的方法证明STK19参与TCR并且是TCR复合物的组分。随后同样也用冷冻电镜解析了包含STK19的TCR复合物结构，发现了STK19与RPB1、CSA、UVSSA以及DNA存在相互作用，但不同的是他们鉴定到了多种不同的构象。通过分析这些构象，认为STK19可能影响了TCR复合物的稳定性。作为支持这一观点的证据，作者利用免疫共沉淀、定量质谱、FRAP和体外生化反应等技术，发现STK19缺失会严重影响UVSSA与TFIIH的招募，阻碍CRL4CSA对RPB1-K1268的泛素化和损伤位点上PolII的解离与降解。最后，同样利用AlphaFold预测了STK19与XPD的相互作用，推测STK19直接参与TFIIH的准确装载。胡晋川课题组首先利用检测损伤和修复分布的Damage-seq和XR-seq技术，证明人类细胞中STK19缺失会严重阻碍TCR。随后利用检测蛋白-DNA损伤相互作用的PADD-seq技术发现STK19以一种依赖于CSA的方式被招募到损伤位点。通过AlphaFold预测发现STK19与CSA和RPB1存在相互作用，这两个相互作用都得到了体外pull-down实验的证实。进一步研究发现STK19不影响UVSSA的招募或者RPB1-K1268泛素化，但促进了UVSSA-K414的单泛素化。然而，表达UVSSA泛素化缺陷突变蛋白的细胞仍然具有一定水平的TCR，而STK19缺失抑制了残余的修复活性，表明STK19还有不依赖于UVSSA泛素化的功能。PADD-seq实验发现STK19缺失阻止了TFIIH的招募，体外pull-down实验证明STK19与TFIIH复合物具有直接的相互作用。AlphaFold预测发现STK19可以与TFIIH的亚基XPD结合，在此基础上将PolII-TCR上游复合物与包含TFIIH的下游复合物结构进行叠加，发现TFIIH可以准确定位到PolII下游，提示STK19可以帮助TFIIH以正确的方式装载到DNA模板上。复旦大学生物医学研究院/附属上海市第五人民医院的双聘PI胡晋川是论文的通讯作者，复旦大学生物医学研究院博士研究生谈远清和高孟为论文的共同第一作者。本研究获得了复旦大学附属肿瘤医院/生物医学研究院徐彦辉研究员和中科院分子细胞卓越中心孟飞龙研究员的大力支持。Walter团队则是另辟蹊径，以非洲爪蟾卵提取物为基础，首次建立了高等真核生物转录偶联修复的体外反应体系。利用该体系，作者发现STK19与已知的TCR因子CSB、CSA、UVSSA及ELOF1一样，都是TCR所必需的。AlphaFold预测STK19与RPB1、CSA、DDB1及XPD都存在相互作用。随后作者也用冷冻电镜解析了包含STK19的TCR复合物结构，实际结构与预测的结构非常相似，只有UVSSA的VHS结构域发生了不超过8Å的位移。复合物结构验证了上述相互作用（除了XPD）并发现了没有预测到的STK19-UVSSA相互作用，然而突变UVSSA与STK19结合的残基几乎不影响TCR，而STK19与CSA和DDB1的相互作用则是TCR所必需的。此外，将STK19参与结合XPD的残基进行突变也会抑制TCR。基于AlphaFold和已知结构的预测提示STK19是帮助TFIIH准确装载的关键因子。上述研究都表明STK19是一个新的TCR核心因子，与多个已知修复因子存在相互作用，且在TFIIH装载中发挥了关键作用。这些研究改变了目前对TCR的认知，在阐明人类TCR分子机制的道路上迈出了重要的一步。然而由于技术手段的限制，不同团队对STK19参与TCR的具体机制提出了不同的解释，因此未来对STK19功能和机制的进一步研究对揭示人类TCR的分子机制具有重要意义。原文链接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkae787
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.018
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.10.030
制版人：十一
1. Bohr, V.A., Smith, C.A., Okumoto, D.S. & Hanawalt, P.C. DNA-Repair in an Active Gene - Removal of Pyrimidine Dimers from the Dhfr Gene of Cho Cells Is Much More Efficient Than in the Genome Overall. Cell 40, 359-369 (1985).2. Troelstra, C. et al. Ercc6, a Member of a Subfamily of Putative Helicases, Is Involved in Cockaynes-Syndrome and Preferential Repair of Active Genes. Cell 71, 939-953 (1992).3. Henning, K.A. et al. The Cockayne-Syndrome Group-a Gene Encodes a Wd Repeat Protein That Interacts with Csb Protein and a Subunit of Rna-Polymerase-Ii Tfiih. Cell 82, 555-564 (1995).4. Zhang, X. et al. Mutations in UVSSA cause UV-sensitive syndrome and destabilize ERCC6 in transcription-coupled DNA repair. Nat Genet 44, 593-7 (2012).5. Schwertman, P. et al. UV-sensitive syndrome protein UVSSA recruits USP7 to regulate transcription-coupled repair. Nat Genet 44, 598-602 (2012).6. Nakazawa, Y. et al. Mutations in UVSSA cause UV-sensitive syndrome and impair RNA polymerase IIo processing in transcription-coupled nucleotide-excision repair. Nat Genet 44, 586-92 (2012).7. Tufegdzic Vidakovic, A. et al. Regulation of the RNAPII Pool Is Integral to the DNA Damage Response. Cell 180, 1245-1261 e21 (2020).8. Nakazawa, Y. et al. Ubiquitination of DNA Damage-Stalled RNAPII Promotes Transcription-Coupled Repair. Cell 180, 1228-1244 e24 (2020).9. van der Weegen, Y. et al. ELOF1 is a transcription-coupled DNA repair factor that directs RNA polymerase II ubiquitylation. Nat Cell Biol 23, 595-607 (2021).10. Geijer, M.E. et al. Elongation factor ELOF1 drives transcription-coupled repair and prevents genome instability. Nat Cell Biol 23, 608-619 (2021).11. Yin, C.Q. et al. Pharmacological Targeting of STK19 Inhibits Oncogenic NRAS-Driven Melanomagenesis. Cell 176, 1113-1127 e16 (2019).12. Rodríguez-Martínez, M. et al. Evidence That STK19 Is Not an NRAS-dependent Melanoma Driver. Cell 181, 1395-1405 e11 (2020).13. Boeing, S. et al. Multiomic Analysis of the UV-Induced DNA Damage Response. Cell Reports 15, 1597-1610 (2016).14. Olivieri, M. et al. A Genetic Map of the Response to DNA Damage in Human Cells. Cell 182, 481-496 e21 (2020).15. Kokic, G. et al. Structural basis for RNA polymerase II ubiquitylation and inactivation in transcription-coupled repair. Nat Struct Mol Biol (2024).
BioART战略合作伙伴
（*排名不分先后）
转载须知
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
