重组戊型肝炎疫苗宿主细胞残余DNA荧光染色法检测方法的建立和验证

目的   建立检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量的荧光染色法，并进行方法验证。

方法   采用λDNA作为标准品建立标准曲线，重组戊型肝炎疫苗纯化后原液作为样品，进行线性、准确度以及精密度的验证。

结果   该方法在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性，决定系数大于0.99；准确性验证中DNA残留量加标回收率在90.00%~110.00%之间，且加标回收率相对标准偏差均小于15.00%。重复性验证和中间精密度验证的相对标准偏差分别为6.62%和10.30%，均小于15.00%。

结论   该方法快速、灵敏、准确，可以检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量。

戊型肝炎（戊肝）病毒为单股正链RNA病毒，主要通过粪-口途径传播，可引起戊肝。全球每年约发生2 000万例戊肝病毒感染，其中约330万戊肝病例，7万例与戊肝病毒感染相关的死亡病例。我国属于戊肝高发国家，近年来戊肝已成为急性病毒性肝炎的常见类型之一，发病人数已超过甲型肝炎，戊肝疫苗（hepatitis E vaccine，HepEV）的研发显得尤其重要。

近年来，随着基因工程技术的发展，基因重组疫苗的研发已愈发成熟，大肠埃希菌、酵母以及哺乳动物细胞等都已成为重组蛋白疫苗的宿主细胞。兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）第四研究室研发的HepEV由重组大肠埃希菌表达的病毒抗原经纯化冻干后制成，尽管经过多步纯化去除杂质，但宿主细胞大肠埃希菌的DNA仍有微量残留。不同宿主细胞DNA进入人体后可造成多种多样的后果，如致癌性和感染性。考虑到宿主细胞残留DNA的潜在安全风险，建立残留DNA定量测定方法并对其进行方法学的验证十分重要。本研究拟选用荧光染色法对HepEV原液中残余宿主DNA的含量进行定量测定。特异性荧光染料PicoGreen与双链DNA结合成的复合物在480 nm波长激发下产生荧光信号，检测波长在520 nm。由于一定DNA浓度范围内荧光强度与DNA浓度成正比，因此可根据荧光信号强度计算重组HepEV供试品中的DNA残留量。同时，根据中国药典2020年版三部（药典三部）中分析方法验证指导原则对建立的残余DNA定量方法进行方法学验证。

重组HepEV吸附前原液，由兰州公司第四研究室制备。

Quant-iT^TM PicoGreen^TM dsDNA试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司，黑色酶标板购自美国康宁公司；酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司。

将20×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸〔tris（hydroxymethyl） aminomethane-ethylenediamine-tetraacetic acid，TE〕用灭菌注射水稀释为1×TE缓冲液。用稀释好的TE缓冲液将DNA标准品配成80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500及1.250 ng/ml的标准品溶液。将DNA标准品溶液和供试品溶液加至黑色96孔酶标板中，每孔100 μl，做3个复孔。用TE缓冲液200倍稀释双链DNA荧光染料，然后于黑色96孔酶标板中加入稀释的荧光染料，每孔100 μl。避光操作，混匀后于室温静置5 min。用酶标仪在激发波长480 nm、发射波长520 nm处测定荧光强度，读值在5 min内完成。以1×TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定标准品溶液和供试品溶液的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程即求得供试品DNA浓度。

1.4.1　线性关系　用稀释好的TE缓冲液将λDNA标准品配制成80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500及1.250 ng/ml的标准品溶液，每个浓度各6份。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，得出线性决定系数（R²）。

1.4.2　准确度　考察不同浓度的供试品在加标量低、中、高3种不同浓度水平下的回收率。取不同浓度的3份供试品溶液按1∶1比例各加入3种不同浓度的标准品，共制备9份供试品，高、中、低理论加标浓度分别为40.000、20.000以及10.000 ng/ml。每份供试品做3个复孔，结果取均值。根据标准曲线计算实际浓度，计算样品加标回收率。回收率=（实测值﹣供试品中被测成分量）÷加入标准品量×100%。

1.4.3　精密度

1.4.3.1　重复性　将供试品重复检测6次，计算6次残留DNA结果及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。HepEV吸附前原液宿主细胞DNA残留量（ng/μg）=吸附前原液宿主细胞残留DNA浓度（ng/ml）÷吸附前原液的蛋白浓度（μg/ml），其残留DNA浓度的质量标准为不超过0.1 ng/μg。每剂HepEV的DNA残留量（ng）=吸附前原液宿主细胞残留DNA浓度（ng/μg）×每剂抗原含量（μg）。

1.4.3.2　中间精密度　考察不同分析人员、不同日期对精密度的影响。取供试品6份，3 d内由2人测定DNA残留量，每次测定2份供试品，同时每份供试品做3个复孔，结果取3个复孔的均值。结合6份供试品残留量试验数据，计算6次结果的RSD。

线性验证共制备6份不同浓度的标准品溶液绘制标准曲线，共进行6次检测。以标准品溶液的浓度为纵坐标，荧光强度值为横坐标作线性回归。由表1可知，标准品溶液在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性关系，R²均＞0.99。

供试品的加标回收率见表2，供试品加标10.000、20.000、40.000 ng/ml的回收率均在90.00%~110.00%之间，且加标回收率RSD均小于15.00%，表明该方法准确度符合要求。

2.3.1　重复性　将供试品重复测定6次后，测试结果平均残留DNA浓度为0.019 ng/μg，重复性RSD为6.62%（表3），所有结果均符合质量标准（≤0.1 ng/μg）。

2.3.2　中间精密度　由表4可知，不同人员和不同时间测量的供试品DNA残留量均符合质量标准，均值为0.018 ng/μg，RSD为10.30%，表明本方法中间精密度检测符合要求。

生物制品在生产过程中，尽管经过下游工艺去除了大量的宿主细胞DNA，但是仍有微量的DNA残留，导致有致癌和感染的风险。为了保证生物制品的安全性，各监管机构对生物制品中的残留外源DNA制定了严格的标准。药典三部规定，以中国仓鼠卵巢细胞生产的生物制剂中DNA残留量不能超过10 pg/剂，以真菌和细菌生产的疫苗中DNA残留量不能超过10 ng/剂。如今，宿主细胞残留DNA已作为生物制品安全性评价的重要指标，药典三部中介绍了3种外源性DNA残留量测定的方法：DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。

本研究中建立了检测重组HepEV残余宿主DNA荧光染色法，并对建立的方法进行了线性、准确性以及精密度的验证。由验证结果可知残余DNA含量线性R²均＞0.99；准确性验证高中低浓度的加标回收率均在90.00%~110.00%范围内；重复性和中间精密度RSD均在＜15.00%的可接受范围内，表明该方法线性良好、准确性和精密度高，可用于检测重组HepEV残余DNA的含量。荧光染色法同DNA探针法相比，不受工程菌种类限制，且简便、快速；与定量PCR法相比，其操作简单，耗时短，也不需要设计特异性引物。

需要注意的是，由于荧光染色法荧光信号易受干扰，特异性较差，因此所有使用的材料和试剂都必须不含DNA，避免环境DNA污染。

张巧玲¹  张志豪²  秦海艳¹  杨林鹏¹  杨俊杰¹

¹兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室， 兰州  730030；²兰州生物制品研究所有限责任公司中试研究室， 兰州  730030

通信作者：杨俊杰，

Email：[email protected]

引用本文：张巧玲, 张志豪, 秦海艳, 等. 重组戊型肝炎疫苗宿主细胞残余DNA荧光染色法检测方法的建立和验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 203-206.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240105-00002