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单细胞揭示ASCL1+和NEUROD1+ SCLC细胞的分子特征和进化轨迹

生信菜鸟团 · 公众号 · 生物 · 2024-10-20 23:26

正文

Molecular features and evolutionary trajectory of ASCL1+ and NEUROD1+ SCLC cells

文献概述

背景

小细胞肺癌（SCLC）是最具侵袭性的肺癌亚型，没有公认的形态学或遗传异质性。根据ASCL1、NEUROD1、POU2F3和YAP1四种转录因子的表达，SCLC分为四种亚型。然而，这些不同亚型的生物学功能在很大程度上尚未表征。是否有可用于区分不同SCLC亚型的细胞表面标志物？

方法

使用单细胞RNA-Seq研究了切除的人原发SCLC组织的瘤内异质性。此外进行了一系列体外和体内功能研究，以揭示SCLC亚型的独特特征。

结果

ASCL1⁺和NEUROD1⁺ SCLC细胞在同一人类原发性SCLC组织中共存。与ASCL1⁺ SCLC细胞相比，NEUROD1⁺ SCLC细胞的上皮特征降低且缺乏EPCAM表达。因此，EPCAM可以被视为区分ASCL1⁺ SCLC细胞和NEUROD1⁺ SCLC细胞的细胞表面标志物。进一步证明NEUROD1⁺ SCLC细胞比ASCL1⁺ SCLC细胞表现出更高的转移能力，并且可以来源于ASCL1⁺ SCLC细胞。

数据

GSE164145和GSE164404

文献内容

1.单细胞RNA测序揭示了SCLC的瘤内异质性

使用10×平台对从两个新切除的人原发SCLC组织，质控后保留7425个细胞（SCLC1中2,001个细胞，SCLC2中5,424个细胞），与参考细胞表现出相似CNV模式的细胞在 SCLC中被归类为非恶性细胞。

在SCLC1中0、1、2、4、5和6表现出较高的神经内分泌（NE）评分。表达高水平的 SOX1、ELAVL3、ELAVL4，这些标志物在SCLC中高表达，被归类为NE SCLC细胞。ASCL1和NEUROD1在NE SCLC细胞中相互排斥表达。0、1、2、4和5中的细胞表达ASCL1但不表达NEUROD1，而6中的细胞表达NEUROD1但不表达ASCL1。极少数恶性细胞同时表达ASCL1和NEUROD1。(有ASCL1 90%和NEUROD1 50%，有一些都是重叠的吧应该？但是我也没看到切片，暂时持保留意见)

在SCLC2中，大多数癌细胞表达ASCL1。NEUROD1⁺细胞没有聚集在一起；NEUROD1和ASCL1的表达仍然表现出互斥的模式。一小部分恶性细胞3不表达ASCL1、NEUROD1、YAP1和POU2F3。

此外，3不表达SOX1、ELAVL3或ELAVL4，表明3可能是LCNEC细胞。与NE SCLC细胞相比，3表达高水平的CHCHD2、NDUFB11、LSM4、HMGN2和大量核糖体蛋白，表明正在经历非常活跃的蛋白质合成。GSEA也一致的显示这些细胞表现出线粒体ATP合成耦合电子传递和氧化磷酸化途径的激活增加。

2.鉴定EPCAM作为细胞表面标志物，以区分ASCL1+和 NEUROD1+ SCLC细胞

与ASCL1⁺ SCLC细胞相比，NEUROD1⁺ SCLC细胞表现出富集的上调神经元分化和神经肽信号通路，下调靶向ER的蛋白质、ATP合成耦合电子传递、角质化和表皮发育途径。上皮标记基因(EPCAM、CDH1、KRT8、KRT18 和 KRT19)以及细胞紧密连接基因(CLDN3 、 F11R 和 CLDN7)和细胞间粘附相关基因(ARG2、EGR3 和DMTN) 降低。与细胞-基质粘附相关的基因，如EFNA5、CASK和ITGA7，以及细胞-神经元迁移特征基因，包括NRP2和RELN，在NEUROD1⁺细胞中上调。

细胞表面蛋白EPCAM在ASCL1⁺和NEUROD1⁺细胞中差异表达。与ASCL1⁺ SCLC细胞相比，NEUROD1⁺ SCLC细胞表现出上皮表型降低但神经表型增强，并且EPCAM可用作区分ASCL1⁺和NEUROD1⁺ SCLC细胞的细胞表面标志物。

进一步在多种人SCLC细胞系中证实SCLC细胞中EPCAM、ASCL1和NEUROD1之间的相关性

EPCAM在H69和H146细胞中的表达极高，但在H82和H446细胞中表达极低，先前的报告将H69和H146细胞定义为表达ASCL1的亚型，将H82和H446细胞定义为表达NEUROD1的亚型，支持EPCAM在ASCL1⁺中高表达，但在NEUROD1 SCLC细胞中被抑制。

H526细胞的EPCAM表达具有异质性，其中3-4%的细胞缺乏EPCAM。H526细胞被归类为表达POU2F3的亚型。纯化出EPCAM^hi和EPCAM^lo H526细胞，EPCAM^hi H526细胞表达高水平的ASCL1，而EPCAM^lo H526细胞表达高水平的NEUROD1。

同样，LCNEC细胞系H1155中EPCAM表达也具有异质性（15%细胞缺乏EPCAM），表现出相似的EPCAM表达模式：EPCAM^hi H1155细胞表达高水平的ASCL1，而 EPCAM^lo H1155细胞表达高水平的NEUROD1。在接种后第30天，绝大多数EPCAM^hi H526和H1155细胞仍以非贴壁漂浮聚集体的形式生长。EPCAM^lo H1155细胞以松散聚集体或单细胞的形式生长，底物粘附轻微。生长模式的差异与NEUROD1⁺ SCLC 细胞中细胞间粘附基因的较低表达和细胞间基质粘附基因的较高表达一致。

3.ASCL1+ 癌细胞可以转化为 NEUROD1+ 癌细胞

在EPCAM^hi H526和H1155细胞培养物中，EPCAM^lo 细胞在培养3天后开始出现，并且 EPCAM^lo 细胞的百分比在培养过程中持续增加，NEUROD1表达增加。

分离了EPCAM^hi H1155的单个克隆，测试从EPCAM^hi细胞到EPCAM^lo细胞的转化频率。培养30天后，生长了8个EPCAM^hi（ASCL1⁺）克隆。虽然一个EPCAM^hi克隆保留了EPCAM^hi状态，但8个EPCAM^hi克隆中有7个转化并停留在不同的中间转化阶段，表明控制转化的转录程序在细胞周期中是可遗传的，并且H1155细胞具有高度异质性。这些结果表明，ASCL1⁺ SCLC细胞可以转化为NEUROD1⁺ SCLC细胞；然而，NEUROD1⁺ SCLC细胞不能转化为ASCL1⁺ SCLC细胞。在ASCL1⁺ H526和H1155细胞中敲低 EPCAM对ASCL1或NEUROD1的表达没有影响，表明EPCAM不参与此子类型转换。

使用Monocle 3观察了从ASCL1⁺ SCLC细胞亚群（4、6）到^NEUROD1+SCLC 细胞（10）的发育轨迹，正常上皮细胞（AT2 细胞）注释为根，观察到从4和6到10的清晰定向流。然而没有观察到从其他 ASCL1⁺（0、1、9）到NEUROD1⁺ SCLC细胞的流向（表明ASCL1⁺ SCLC细胞之间存在异质性，并且并非所有ASCL1⁺ SCLC细胞都能转化为^NEUROD1+ SCLC 细胞)，这可能是H69和H146细胞保持ASCL1⁺ 表型的原因。

这一发现与ASCL1的生理表达模式一致，ASCL1在神经系统发育过程中的表达早于NEUROD1。

4.NEUROD1+ SCLC细胞表现出比ASCL1+ SCLC细胞更高的转移能力

在Transwell迁移测定中，与EPCAM^hi H1155细胞相比，纯化的EPCAM^lo H1155细胞表现出增强的迁移能力。然后将EPCAM^hi和 EPCAM^lo H1155细胞与CAFs联合皮下接种到NOD/SCID小鼠中。接种4周后，EPCAM^hi和EPCAM^lo H1155细胞产生了大小相当的皮下肿瘤，表明这两种亚型在体内具有相似的增殖指数。然而，EPCAM^hi和EPCAM^lo H1155 皮下肿瘤表现出不同的组织学形态。EPCAM^lo H1155肿瘤细胞包含一个或多个突出的核仁，核仁旁染色质清除。然而，EPCAM^hi H1155 肿瘤显示出混合组织学模式：虽然大多数肿瘤细胞含有致密的细胞核，但一小部分肿瘤细胞表现出与EPCAM^lo H1155肿瘤细胞相似的形态。

在EPCAM^hi H1155肿瘤中检测到ASCL1⁺和^NEUROD1⁺肿瘤细胞，但在 EPCAM^lo H1155肿瘤中仅检测到NEUROD1⁺肿瘤细胞，进一步证实了从ASCL1⁺到NEUROD1⁺肿瘤细胞的转变。

EPCAM^hi H1155肿瘤界限清楚，无侵袭，而EPCAM^lo H1155细胞侵入周围组织，表明EPCAM^lo侵袭能力高于EPCAM^hi H1155细胞。与这些发现一致，携带EPCAM^lo H1155细胞的小鼠接种在肺组织中的人类癌细胞比携带EPCAM^hi H1155细胞的小鼠多得多。这些结果表明，NEUROD1⁺癌细胞比ASCL1⁺癌细胞表现出更高的转移能力。

验证：测试了10名患者的6个切除的人原发性SCLC肿瘤组织和8个淋巴结（患者8、9和10）或脑转移（患者3、4、5、6和7）中ASCL1和NEUROD1的表达。与体外和体内分析一致，ASCL1⁺肿瘤细胞在原发性肿瘤组织中富集，而NEUROD1⁺肿瘤细胞在转移瘤中富集。

5.ASCL1+和NEUROD1+ SCLC对依托泊苷和顺铂表现出相似的反应

使用异种移植动物模型评估了ASCL1⁺和NEUROD1⁺群体对SCLC标准全身化疗药物（依托泊苷和顺铂）的反应。EPCAM^hi和EPCAM^lo H1155皮下肿瘤均表现出对依托泊苷和顺铂的反应。因此，尽管EPCAM^hi和EPCAM^lo肿瘤细胞表现出多种不同的特征，但它们与标准SCLC化疗药物具有相似的敏感性。

总结

这项研究中两个SCLC的单细胞RNA-Seq数据。SCLC1比SCLC2更具异质性。SCLC1包含ASCL1⁺和NEUROD1⁺亚型。与ASCL1⁺癌细胞相比，NEUROD1⁺癌细胞表现出更多的神经元和神经元迁移特征，并且可以来源于ASCL1+ SCLC细胞。
NEUROD1⁺细胞表现出上皮特征降低且缺乏EPCAM表达。因此研究确定了细胞表面标志物EPCAM来区ASCL1⁺ SCLC细胞和NEUROD1⁺ SCLC细胞，使得对SCLC细胞的不同亚型进行分选以进行深度分子表征成为可能。