黄葵四物方对尿毒素分子硫酸对甲酚在宿主细胞内代谢通路及转运环节的影响

中药被认为是一种成本低、效益高的治疗手段，几十年来，中药治疗慢性重大疾病的有效性和安全性研究取得了很大的进展，越来越多的患者受益于中药。本课题组在临床治疗 CKD 药物黄葵胶囊的基础上，进一步优化得到中药复方黄葵四物方。该复方是由黄葵、黄芪、虎杖和姜黄 4 味中药配伍而成。 组方具有清利活血、通淋消肿、补泻同施、标本兼顾之功。本课题组前期研究发现，黄葵四物方可显著减轻 CKD 模型大鼠的肾脏炎症及纤维化水平；显著抑制 CKD 模型大鼠血浆、肝脏和肾脏中尿毒素分子 PCS 的蓄积 ^[10] ，提示黄葵四物方保护 CKD 的作用可能与其抑制体内 PCS 蓄积相关。

PCS 在宿主体内合成及转运过程主要包括 2 个环节。 PCS 的合成环节：食物中的酪氨酸被肠道菌群分解产生对甲酚，对甲酚可在结肠和肝脏内被磺基转移酶 （ sulfotran-sferase1a1 ， SULT1A1 ） 代谢合成 PCS ； PCS 的转运环节：血浆中的 PCS 经由肾脏阴离子转运体（ organic anion transporter ， OAT ）转运进入肾脏细胞并最终通过尿 液排泄 ^[8] 。最新研究表明，中药通过干预肠道菌群可有效改善 CKD 、心血管疾病等多种慢性疾病 ^[11-14] 。 本课题组前期研究发现黄葵四物方可作用于肠道菌群，调控肠道菌群中 PCS 前体分子对甲酚的合成途径，抑制肠道菌群中对甲酚的合成。然而，黄葵四物方是否影响 PCS 在宿主细胞中的合成环节以及向肾脏内的转运环节尚不清楚。因此，本研究进一步探究黄葵四物方对尿毒素 PCS 在宿主细胞内的合成及转运环节的影响。

1.1 仪器

ChemiDoc XRS 凝胶成像系统（美国 BIO-RAD 公司）； 7500 Real Time PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）；超高效液相色谱三重四极杆质谱联用（ Ultraperformance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry ， UPLC-TQ/MS ）和高效液相色谱 - 紫外 - 荧光检测器（ high performance liquid chromatography-ultraviolet/fluorescencedetector ， HPLC-UV-FLD ）均购自美国 Waters 公司； Microcl 21R 常温低速离心机（ Thermo 公司）。

1.2 实验动物

1.3 药物及试剂

2 方法

2.1 黄葵四物方溶液的制备

称取适量黄葵、黄芪、虎杖、姜黄粉末，按照 3.5 ︰ 5 ︰ 1.5 ︰ 1 的比例混匀， 60% 乙醇提取 3 次，每次 1.5 h ，提取液合并进行浓缩，浓缩后生药量 2g/mL ，其中主要药效成分质量分数分别为毛蕊异黄酮苷 0.35 mg/g 、虎杖苷 2.54 mg/g 、金丝桃苷 3.90 mg/g 、异槲皮苷 2.56 mg/g 、槲皮苷 0.29 mg/g 、杨梅素 0.85 mg/g 、白藜芦醇 13.42 mg/g 、毛蕊异黄酮 0.22 mg/g 、槲皮素 0.06 mg/g 、姜黄素 1.25 mg/g 、大黄素 0.54 mg/g 。

2.2 PCS 的 UHPLC -TQ/MS 分析

2.2.1 色谱条件 采用 Acquity UHPLC ^TM 系统、 Acquity UHPLC BEH C ₁₈ 色谱柱（ 100 mm × 2.1 mm ， 1.7 m m ）进行色谱分析。流动相为 0.1% 甲酸水（ A ）和乙腈（ B ），具体色谱参数见表 1 。

2.2.2 质谱条件 采用 Xevo Triple Quadrupole Mass Spectrometer （ TQ/MS ）、选择性反应检测法进 行质谱分析。检测参数：毛细管电压为 3.0 kV ，离子源温度为 150 ℃，脱溶剂温度为 550 ℃，锥孔气 流速度为 50 L/h ，脱溶剂气体积流量为 1000L/h 。 PCS 质谱检测条件见表 2 。

2.3 黄葵四物方对宿主体内 PCS 合成的影响

2.3.1 黄葵四物方对小鼠体内 PCS 含量的影响 将 10 只 C57BL/6 雄性小鼠随机分为 2 组，分别为正常组和黄葵四物方组，每组 5 只。对照组小鼠 ig 无菌超纯水，黄葵四物方组小鼠 ig 黄葵四物方水溶液（ 2.5 g/kg ^[10] ），连续 ig 28 d 。第 28 天，对照组和黄葵四物方组小鼠 ig 对甲酚（ 80 mg/kg ）， 2 h 后进行眼眶取血。实验结束后，将小鼠用苯巴比妥钠（ 0.1 mL/10 g ）麻醉，采集小鼠结肠和肝脏，脱颈椎处死小鼠。

将血液样品 4000 r/min 离心 10 min ，离心后取上清即得血浆。称取脏器样品于 EP 管内，每克样品加入 1 mL PBS 溶液， 60 Hz ， 90 s 匀浆后， 13 000 r/min 离心 10 min ，取上清。所有样品以 10 ∶ 1 比例加入 200 μg/mL 氯霉素作为内标物，再以 1 ∶ 3 比例加入乙腈，充分混匀， 13 000 r/min 离心 10 min ，取上清至进样小瓶中，置于冰上。按照“ 2.2 ”项的方法测定 PCS 含量。

2.3.2 黄葵四物方对小鼠肝脏中 SULT1A1 活性的影响 实验分组和给药同“ 2.3.1 ”项。称取各组小鼠肝脏，按 1 ∶ 4 （ mg/L ）的比例加缓冲溶液（将 5 mmol/L 的 MgCl ₂ ·6H ₂ O 溶解在 100 mmol/L pH 7.4 的 Tris-HCl 中）， 2 颗钢珠， 60 Hz 、 90 s 匀浆， 4 ℃， 13 000 r/min 离心 20 min ，取上清液。将上清液在 37 ℃中孵育 3 min ，取 240 μL 上清液加 10 μL 250 mol/L PAPS （ 3′- 磷酸腺苷 -5′- 磷酰硫酸，底物，为对甲酚提供硫酸基团，促进对甲酚合成 PCS ）， 37 ℃孵育 0 、 5 、 30 、 60 min ，孵育完成后，加 0.3 mL 甲醇终止反应。涡旋后离心（ 12 000 r/min 、 10 min ），取上清液至进样小瓶。通过 HPLC-UV-FLD 分析上清液中 PCS 含量，采用 C ₁₈ 柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 m m ， Alltima ，美国），柱温为 35 ℃，进样时间为 5.5 min ，波长为 260 ～ 300 nm ，流动相为乙酸铵 - 乙腈（ 75 ︰ 25 ）。通过计算单位时间内 PCS 生成量反映小鼠肝脏中 SULT1A1 的酶活性。

2.3.3 黄葵四物方对小鼠 结肠和肝脏中 SULT1A1 mRNA 和蛋白表达的影响 实验分组和给药同“ 2.3.1 ”。将小鼠结肠、肝脏组织置于 Trizol 试剂中 进行研磨裂解， 12 00 0× g 离心 10 min ，取上清，加入氯仿萃取静置分层， 12 000 × g 离心 15 min ，取最上层溶液，加入异丙醇充分混匀，静置， 12 000 × g 离心 10 min ，弃上层液体，加入 75% 乙醇涡旋， 7500 × g 离心 5 min ，取上清， 3 次，弃去液体，倒扣晾干，加入 DEPC 水复溶 mRNA ，并按照逆转试剂盒说明书获得互补 DNA （ complementary DNA ， cDNA ）。使用 PCR 基因扩增仪进行扩增。 PCR 反应每个样品进行 3 次重复实验， PCR 扩增反应条件为 94 ℃预变性 30 s ，然后进入循环阶段，每个循环包括 94 ℃变性 5 s ， 60 ℃退火 34 s ， 72 ℃延伸 30 s ，共 45 个循环。最 终以目的基因与 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde- 3-phosphatedehydrogenase ， GAPDH ）的含量比值表示目基因的表达水平。使用的引物序列见表 3 。扩增数据按照 2 ^{−ΔΔ C t} 的方法进行数据处理。

2.3.4 黄葵四物方对大鼠体内 PCS 合成环节的影响 将 15 只 SD 雄性大鼠随机分为 3 组，分别为对照组、对甲酚组和黄葵四物方组，每组 5 只。对照组大鼠每日上午 ig 生理盐水 1 次，对甲酚组及黄葵四物方组大鼠每日上午 ig 对甲酚水溶液（ 40 mg/kg ） 1 次，此外，黄葵四物方组大鼠每日下午 ig 黄葵四物方水溶液（ 1.25 g/kg ^[10] ） 1 次，连续 ig 10 d 。第 11 天， ig 对甲酚 5 min 后，黄葵四物方组 ig 黄葵四物方， 1 h 后眼眶取血，采集的血液置于含有 15 g/L EDTA 水溶液的 EP 管中。取血后， ip 2.0% 苯巴比妥钠溶液（ 30 mg/kg ）麻醉大鼠。用 4 ℃的 PBS 作为灌流液灌注。实验结束后，大鼠已经死亡。采集大鼠结肠、肝脏和肾脏。血液和脏器样品处理同“ 2.3.1 ”项，按照“ 2.2 ”项的方法测定 PCS 含量。

2.4 黄葵四物方对宿主体内 PCS 转运的影响

2.4.1 黄葵四物方对小鼠体内 PCS 转运进入肾脏的影响 取 C57BL/6 雄性小鼠 9 只，随机分为 2 组，对照组为 4 只，黄葵四物方组为 5 只。对照组每日 ig 生理盐水 1 次；黄葵四物方组 ig 黄葵四物方水溶液（ 2.5 g/kg ），连续 ig 28 d 。第 28 天，对照组和黄葵四物方组小鼠 ip PCS （ 20 mg/kg ）， 0.5 h 后眼眶 取血。实验结束后，用 2.0% 苯巴比妥钠（ 0.1 mL/10 g ） 麻醉小鼠，采集小鼠肾脏，脱颈椎处死小鼠。血液和脏器样品处理同“ 2.3.1 ”项，按照“ 2.2 ”项的方法测定 PCS 含量。

2.4.2 黄葵四物方对小鼠肾脏中机阴离子转运体 OAT1/3 mRNA 和蛋白表达的影响 实验分组和给药同“ 2.4.1 ”项。取小鼠肾脏组织加入 2 颗钢珠并用 Trizol 试剂进行研磨裂解， 12 000 × g 离心 10 min ，取上清，加入氯仿萃取静置分层， 12 000 × g 离心 15 min ，取最上层溶液，加入异丙醇充分混匀，静置， 12 000 × g 离心 10 min ，弃上层液体，加入 75% 乙醇涡旋， 7500 × g 离心 5 min ，取上清， 3 次，弃去液体，倒扣晾干，加入 DEPC 水复溶 RNA ，仪器检测。并按照逆转录试剂盒说明书转录得到互补的 cDNA ，最终使用 PCR 基因扩增仪进行扩增。 PCR 反应每个样品进行 3 次重复实验， PCR 扩增反应条件为 94 ℃预变性 30 s ，然后进入循环阶段，每个循环包括 94 ℃变性 5 s ， 60 ℃退火 34 s ， 72 ℃延伸 30 s ，共 45 个循环。最后以目的基因与 GAPDH 的含量比值表示目基因的表达水平。使用的引物序列见表 3 。扩增数据按照 2 ^{−ΔΔ C t} 的方法进行数据处理。

2.4.3 黄葵四物方对大鼠体内 PCS 转运进入肾脏的影响 取 SD 雄性大鼠 16 只，随机分为 2 组，分别为正常组和黄葵四物方组，每组 8 只。对照组 ig 生理盐水，黄葵四物方组 ig 黄葵四物方（ 1.25 g/kg ），连续 ig 28 d 。第 28 天，对照组和黄葵四物方组大鼠 ip PCS （ 10 mg/kg ）， 0.5 h 后眼眶取血；取血后， ip 2.0% 苯巴比妥钠溶液（ 30 mg/kg ）麻醉大鼠，在 ip PCS 1 h 后，对大鼠进行腹主动脉取血，后用 4 ℃的 PBS 作为灌流液灌注。实验结束后，大鼠已经死亡，采集大鼠肾脏。血液和脏器样品处理同“ 2.3.1 ”，按照“ 2.2 ”项的方法测定 PCS 含量。对大鼠肾脏中机阴离子转运体 OAT1/3 mRNA 和蛋白表达量的测定同“ 2.4.2 ”项方法。

2.4.4 黄葵四物方对 CKD 模型大鼠 肾脏中 OAT1 和 OAT3 mRNA 表达的影响 将 18 只 SD 雄性大鼠随机分为 2 组，模型组和黄葵四物方组各 9 只。制备 CKD 模型：两组大鼠每日 ig 腺嘌呤溶液（ 200 mg/kg ），连续 ig 2 周。造模结束后，各组大鼠静养 1 周。 1 周后开始给药，模型组每日 ig 超纯水，黄葵四物方组每日 ig 黄葵四物方（ 1.25 g/kg ），连续 ig 56 d 。实验结束后，用 2.0% 苯巴比妥钠溶液（ 30 mg/kg ）麻醉大鼠，用 4 ℃的 PBS 作为灌流液灌注。实验结束后，大鼠已经死亡。采集大鼠肾脏。大鼠 肾脏中 机阴离子转运体 OAT1 和 OAT3 mRNA 表达量的测定同“ 2.4.2 ”项方法。

2.5 统计学方法

采用 GraphPad Prism version 7.0 软件进行数据统计分析。所有数据均以表示（ n ≥ 3 ）。采用 Nonparametric Mann-Whitney Test 进行组间差异性分析。

3 结果

3.1 黄葵四物方对宿主细胞内 PCS 合成的影响

本课题组前期研究发现黄葵四物方可降低慢性肾病模型大鼠血浆、肝脏及肾脏中 PCS 的含量，但尚不明确黄葵四物方是干预了 PCS 的合成环节和 / 或抑制 PCS 向肾脏内的转运环节，从而抑制宿主体内 PCS 蓄积。因此，本研究首先针对结肠和肝脏内 PCS 的合成环节，探讨黄葵四物方对宿主细胞内 PCS 合成的影响。

对甲酚 ig 给予小鼠后可被肠黏膜和肝脏中 SULT1A1 代谢生成 PCS ，小鼠血浆及肾脏内 PCS 水平也相应增加 ^[4] ，可进一步观察黄葵四物方对 PCS 合成环节的影响。黄葵四物方预给药 28 d 后，各组小鼠 ig 对甲酚 2 h 后，利用 UPLC-TQ/MS 检测小鼠血浆、结肠及肝脏内 PCS 含量（图 1-A ）。结果发现，与对照组相比，黄葵四物方可显著降低小鼠血浆中 PCS 的含量（图 1-B ），表明黄葵四物方可干预对甲酚向 PCS 转化的过程。结肠和肝脏是对甲酚向 PCS 转化的关键部位，检测结肠和肝脏中 PCS 含量，结果发现，黄葵四物方对肝脏中 PCS 的蓄积具有一定的抑制趋势（图 1-C ），不影响肠道中 PCS 蓄积（图 1-D ），以上结果提示黄葵四物方可能通过干预小鼠肝脏中 PCS 的合成，从而减少宿主体内 PCS 蓄积。

为了对以上结果进行验证，进一步观察了黄葵四物方对大鼠体内 PCS 合成环节的影响。大鼠 ig 对甲酚及黄葵四物方后，利用 UPLC-TQ/MS 检测血浆、结肠、肝脏和肾脏内 PCS 含量（图 3-A ）。结果发现，与对照组（未给予对甲酚）相比，对甲酚 ig 可显著升高 PCS 在血浆和肾脏内的含量，给予黄葵四物方后，大鼠血浆和肾脏内 PCS 含量存在降低趋势（图 3-B 、 C ）。在结肠和肝脏的检测结果中发现，与对照组相比，对甲酚