来源：丁香学术
近年来，单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）和人工智能驱动的结构预测技术的突破彻底改变了结构生物学领域。2018，AlphaFold 横空出世，两年后发布的 AlphaFold2 更是能够成功预测 98.5% 的人类蛋白质结构，为结构生物学领域带来了重要变革。2024 年 10 月 9 日，瑞典皇家科学院宣布今年的诺贝尔化学奖一半授予美国科学家 David Baker，以表彰其在计算蛋白质设计方面的贡献；另一半则共同授予英国科学家 Demis Hassabis 和 John M. Jumper，以表彰其在蛋白质结构预测方面的贡献。
作为我国最杰出的结构生物学家之一，深圳医学科学院创始院长、深圳湾实验室主任、清华大学讲席教授、北京生物结构前沿研究中心研究员，并荣获 2024 年世界杰出女科学家奖项的颜宁教授，于结构生物学领域深耕多年，发现了多种介导离子和糖跨细胞膜运输的膜蛋白原子结构，揭示了跨膜转运的原理，为生命科学领域带来了巨大的贡献。
2024 年 10 月 9 日，颜宁团队在 PNAS 杂志发表了题为 CryoSeek: A strategy for bioentity discovery using cryoelectron microscopy 的研究文章1，该研究使用冷冻电镜发现了直接从自然环境或本地资源中分离出来的完全未知的生物实体，报道了两个相关的原纤维的结构鉴定，称为 TLP-1a 和 TLP-1b，他们将这类研究新范式称为 CryoSeek，其获得的高分辨率结构先于并指导先前未知物体的识别和功能表征。
图 1 相关研究（图源：[1]）
一、清华大学校园内荷塘水样的低温电镜成像
CryoSeek 的工作流程包括几个步骤：1）从自然来源收集样本；2）用过滤、浓缩等简单程序处理样品；3a）执行标准冷冻样品制备和冷冻电镜数据采集或 3b）通过其他方法，如宏基因组测序和质谱分析来表征样品；4）低温电镜数据处理；5）自动建立模型；6）结合步骤 3b 的其他生物信息学分析结果，根据其结构识别相应的生物实体。
为了证明 CryoSeek 这一新范式的应用，研究人员对从清华荷塘采集的水样进行了成像，之所以选择这个地方是因为清华大学的荷塘因朱自清的《荷塘月色》而闻名于世，因而研究团队将本项研究称为「荷糖月色」计划2。为了保留任何潜在物体的天然结构，在制备冷冻样品之前，收集的水经过简单的过滤和浓缩。随后，许多物质立即在显微照片中显示出来，最容易辨认的是不同长度和厚度的原纤维，他们在该研究中报道了两种相关原纤维的结构特征，被命名为 TLP-1a 和 TLP-1b，其 3D EM 重建在 3.2 Å 和 3.5 Å 分辨率下被确定。由于两种原质物几乎相同，他们选择整体分辨率更高的 TLP-1a 进行结构分析，并使用 TLP-1 这个名称来描述这两种原纤维的共同特征。
图 2 基于 CryoSeek 策略发现天然生物实体（图源：[1]）
二、利用 CryoNet 自动构建结构
TLP-1 的结构特征是怎样的呢？在没有任何先验序列信息的情况下，他们使用 CryoNet 自动构建 TLP-1 原聚物的原子模型。结果发现，自动构建的 TLP-1 模型与 EM 图像基本一致，只有很小的差异。
接下来，他们以 F. bacterium 的 A0A2M8AA21 结构坐标为参考，手工细化了 TLP-1a/b 的模型。他们发现，虽然预测 N 端序列被 AF2 打乱，但在原纤维组装的背景下，它形成了一个延伸的 β 链，而这条 β 链是聚合 TLP-1 原纤维的关键元素。进一步的研究还发现，TLP-1 原聚物通过供体-链交换（Donor-Strand Exchange，DSE）机制堆叠。
图 3 TLP-1 的结构鉴定（图源：[1]）
三、TLP-1a/b 为潜在未分类细菌菌毛
上述发现的 TLP-1a/b 到底属于什么生物类别呢？由于 TLP-1 原纤维是从环境中收集的，预测结构与 TLP-1 相似的蛋白在 UniProt 数据库中都没有特定的功能注释。虽然对实验结构没有得到任何相似的折叠，但他们在检索到的许多相近序列中发现了一个有趣的特征，即所有检索到的细菌起源的实验结构都是通过 DSE 机制组装的菌毛。
随后，他们进一步检索了菌毛代表性的冷冻电镜图谱和结构，包括大肠杆菌的 CS17 粘附菌毛、枯草芽孢杆菌的 Tas 纤维和铜绿假单胞菌的 CupE 菌毛，这些结构有一个共同的特点，即顶部原聚体的 N 端 β1' 链插入到下方原聚体的大结构域中，以完成 Ig 样结构域。然而，不同菌毛的 Ig 样结构域的形状和连接环的复杂程度不同，导致每个菌毛的轮廓和组装参数不同。
TLP-1 与其他三种原纤维的主要区别在于供体原蛋白的相对定位，在 TLP-1 中，原聚体 n+4 提供 n 端 β1' 链以补充启动子 n 中的 β 片；相反，在包括 CS17 在内的所有其他原纤维中，原聚体 n+1 提供 β1' 链。这一结果表明 TLP-1 结构是一种以前未被表征的同源螺旋原纤维的组装模式。
图 4 TLP-1 与其他通过 DSE 机制组装的原纤维的比较（图源：[1]）
该研究标志着结构生物学领域首次将冷冻电镜的应用扩展到直接发现各种生物圈中的未知物体，他们创新性地将该研究范式称为 CryoSeek，使结构生物学成为探索完全未知物体的有效工具。清华荷塘只是一个起点，未来CryoSeek 还可能有助于将结构生物学扩展到结构 X 学，如结构病理学、结构生态学、结构考古学等。研究对象可以扩展到土壤、河流、空气、雨雪、海洋，甚至更为极端的环境，如深海、极地、火山，乃至外太空的生物实体。研究团队希望通过基于冷冻电镜技术开启结构生物学研究全新范式，从而助力多学科的发展2。
参考资料：（上下滑动查阅）
1 Wang T, et al. CryoSeek: A strategy for bioentity discovery using cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Oct 15.
2 PNAS | 颜宁团队利用冷冻电镜技术探索结构生物学研究新范式，深圳医学科学院，2024.10.10
通讯作者：
颜宁，教授、博士生导师，中国科学院院士、清华大学讲席教授、美国科学院外籍院士、美国艺术与科学院外籍院士、美国普林斯顿大学终身讲席教授，深圳医学科学院院长、深圳湾实验室主任，荣获世界杰出女科学家奖等荣誉。主要从事与疾病相关的重要膜转运蛋白、电压门控离子通道的结构与工作机理及膜蛋白调控胆固醇代谢通路的分子机制方面的研究，自 2009 年以来，颜宁作为通讯或者共同通讯作者发表学术研究论文近 80 篇，其中 33 篇发表于 Cell、Nature、Science 等国际顶尖杂志。
李张强，2020 年于清华大学生命科学学院取得博士学位，清华大学水木学者、清华大学高精尖中心卓越学者，主要从事电压门控钠通道与相关药物或毒素的结构生物学研究，以第一作者或共同第一作者在 Science、PNAS 发表多篇研究论文。
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