小师弟一直心情不好，我们来看看他是怎么了（文中有流式实验资料手册、京东卡及外交官双肩包等 666 份惊喜好礼等你领！）
别提了！导师说我的课题要做流式分析实验，但我还是一头雾水，一会儿要配色，一会要调补偿！真不知道该从何学起？
师兄师姐，你们做了那么多次流式实验，推荐点资料哇？
流式确实有点难度，当年刚开始我也是摸不着北。你别着急，流式要从熟悉仪器配置开始，看看激光器和发射光谱。
在流式配色上，同样尽可能减少荧光染料之间的光谱重叠，避免补偿。同时，好的对照，才能保证数据准确。
别说你了，其实我也有好多问题，上一篇论文做了 4 色，如何才能去做更多色？
我也是，流式胞内实验结果审稿很严格，都需设置什么对照？另外，平时都用细胞调节补偿，但靶标表达量少怎么办？
不用趴墙角啦！为了让大家轻松上手流式细胞术，赛默飞世尔科学技术专家联合丁香园，于 10 月 16 日 14:00 给大家带来免疫征途系列课程《细节决定成败，深入解析流式实验的关键因素》，在这里不仅会有流式基础入门知识，大师姐还会对实验中操作难点与重点进行细致地解析，以及多年经验总结的实验工具与资源分享！
请注意，成功报名直播的前 400 名幸运者免费获得赛默飞上百页纸质版的《流式细胞分析实验方案》，包含流式样本制备、细胞刺激、补偿调节及表型分析等 Protocol，干货满满，赶快来领取！在直播当日，还有机会获取网红赛默飞生命科学积木、超值京东卡、外交官双肩包、马克杯等惊喜好礼！
a. 仪器有哪些激光器和滤光片，可以激发哪些荧光染料，可以检测哪些荧光信号；不同荧光染料有各自不同的特点。
a. 提前了解蛋白靶标在样本中的表达量，同时了解荧光染料的亮度。表达量很低的靶标需要搭配亮度高的荧光素。
a. 同一激光激发的染料光谱重叠尽可能地减小
b. 选用不同激光激发的荧光染料，如 FITC/APC
c. 同一细胞上的抗原尽可能地减少光谱重叠
a. 串联染料的信号衰退会降低 APC 或 PE 的灵敏度，最好选用更稳定的串联染料。
b. 避免样本暴露于光、高温或固定剂。如果样本需要固定，请选择十分稳定、有效组织串联染料的信号衰退的固定剂。
a. 这是因为自发荧光在波长较长时迅速降低。在自发荧光很强的细胞上，建议选择红光激发和 APC 标记的抗体。
Panel 中需要加入死活染料，排除非特异性结合信号
a. 这是因为死细胞的自发荧光很强，且死细胞会非特异性结合抗体和染料。
还有 3 条减少光谱重叠的宝藏经验将在直播讲座中与你见面！大师姐将在此次直播中为各位讲解更多的珍贵经验，给你稳妥的实验方案！
在流式实验中，会遇到许多细节问题，在赛默飞《流式细胞分析实验方案》中都可以找到相应的解答，来看看大师姐给出的红细胞裂解方案清单以及全血样本的流式细胞染色实验方案～
在流式分析淋巴组织细胞悬液或外周血之前，通常红细胞（RBC）应当除去。在这本手册中，多种红细胞裂解方法来应对不同的样本处理方式。
方案 A：使用 1X 或 10X 红细胞裂解缓冲液（由氯化铵产生的渗透压破碎无核红细胞）
● A1. 在全血样本中抗体染色后裂解红细胞
● A2. 在大体积人全血样本中裂解红细胞
● A3. 在小鼠 / 大鼠脾脏或骨髓样本中裂解红细胞
适用范围：全血样本（肝素或 EDTA 作为抗凝剂）或组织细胞悬液样本
方案 B：使用一步法固定 / 裂解液 1-step Fix/Lyse Solution（可裂解红细胞并同时固定淋巴细胞）
适用范围：适用于抗体染色后裂红和固定，最终上样分析；也适用于裂红和固定后再使用抗体染色
a. 使用肝素采样管采集全血，或使用含有 10% EDTA 二钾（1 μL/100 μL 全血）的采样管。
b. 取 100 μL 未裂解的全血样本加到 12×75 mm 试管中，分别作为抗体染色管和单色对照管（用于补偿调节）：剩余未裂解的全血样本可制备未染色空白对照管。
a. 准备抗体混合管：将流式抗体加入到流式细胞染色缓冲液中。建议初次测试 1:50 至 1:100 的抗体稀释比例。避光。
b. 将抗体混合物加到 100 μL 全血中。
c. 在 2～8 ℃ 下振荡孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
d. 用 2 mL 流式细胞染色缓冲液洗涤样本。可重复洗涤。
e. 在 4 ℃ 下以 500 ×g 离心 5 分钟。弃掉上清液，然后用 500 μL 流式细胞染色缓冲液重悬细胞。
更多流式细胞实验方案及技巧均会展示在手册中，快来点此报名，前 400 名即可获得上百页流式实验纸质版手册～
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