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Science | 解旋酶介导的连续突变系统——实现哺乳动物细胞上的原位定向进化

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-10-11 08:45

正文

人类基因组中存在多达三十亿的碱基对，因此在基因组学的核心挑战和最终愿景，是描述该三十亿碱基对中，每一个碱基对于特定基因调控及下游蛋白质功能的影响。因此，如何系统且高通量地对目标基因组序列进行诱导突变，成为一项核心技术挑战。当研究者聚焦于单一基因组位点时，如何利用区域性的靶向诱变，模拟自然进化过程，揭示序列与表型之间的关系，领域内仍然缺乏较好的技术平台。

2024年10月11日，来自博德研究所（Broad Institute）和哈佛大学丹娜法博癌症研究中心（Dana-Farber Cancer Institute）的Fei Chen和Bradley E. Bernstein研究组在Science上在线发表题目为Helicase-assisted continuous editing for programmable mutagenesis of endogenous genomes的研究论文（哈佛大学博士研究生Xi Dawn Chen和博后研究员陈则宇为共同第一作者），通过融合解旋酶（Helicase）和脱氨酶（deaminase）形成解旋编辑器（Helicase Editor），并通过nCas9或dCas9将解旋酶编辑器引导至特定基因组靶向区域，成功实现了在人类细胞上原位基因组上的长程，位置饱和的散在诱导突变，创立了在哺乳动物细胞上的原位定向进化系统，并在多种人类细胞系上实现筛选抗药性单碱基突变，RNA剪切酶活位点和原位增强子中的功能性碱基等重要生物学过程。

研究人员首先选择了PcrA M6解旋酶作为切入点，融合了可诱导C->U突变（DNA复制后体现为C->T或反链的G->A）的胞苷脱氨酶AID形成HE，并将靶向特定基因组位点的sgRNA，nCas9(D10A)和HE转染进入HEK293T细胞并突变72小时。研究人员发现只有细胞同时存在HE系统和nCas9-sgRNA系统时，目标靶向区域才会被显著突变。该突变方向以单侧为主，长度可达1kb以上，突变率平均在每个碱基0.5%左右。其中反链的G->A突变为主导突变类型，随着突变时间延长，每条单链上的突变也会随之累积。因此，研究人员将该系统命名为HACE（Helicase-assisted continuous editing）系统，即解旋酶介导的连续突变系统。

接下来，研究人员建立了模块化的HACE体系，搭建了不同解旋酶（BLM,NS3h,PcrA, PcrA M6等），不同脱氨酶（AID, rAPOBEC, TadA, TadDE）及不同Cas9（nCas9 D10A, nCas9 H840A, dCas9）的功能性描述矩阵，系统性的描述了每个组合条件下的突变率，突变方向，G->A和C->T的偏好，同时也实现了A->G或T->C的突变，使得HACE系统可在不同使用场景下，根据目标区域的突变预期特点，来进行工具盒式的置换，实现不同目的的单碱基筛选。

下一步，研究人员将HACE系统用于癌细胞的耐药性机制筛选中。研究人员将靶向MEK1外显子区域的HACE系统导入到A375细胞中，并使用Trametinib和Selumetinib两个MEK1抑制剂进行耐药性点突变筛选。在经历长达20天的耐药性筛选后，研究人员发现存活下来的A375细胞中，富集了G128D，G202E，E203K等多个点突变。利用单碱基编辑器和MAPK通路的活性报告系统验证发现，这些点突变可显著增强MAPK活性，并促进细胞在药物环境下生存和扩增。PDB结构分析进一步发现，以上突变位点均落在药物结合区域周围，阐释了MEK1突变的抗药机制。

进一步的，研究人员将HACE系统应用于鉴定影响RNA剪切的体内酶活突变位点。研究人员将RNA剪切报告系统导入到HEK293FT细胞中，同时设计好靶向SF3B1的多个sgRNA，再将HACE系统整体导入含有报告系统的细胞中。通过报告系统中被异常剪切的mRNA（GFP报告）强度进行亚群分选，筛选出对于RNA剪切有重要影响的细胞亚群，并对于其靶向区域的基因型进行鉴定。研究人员发现并用单碱基编辑和先导编辑验证了多个可影响RNA剪切的SF3B1突变位点，并在PDB结构分析中确认了这些突变所属的蛋白区域是与RNA结合相关的部分。

最后，研究人员设计了多条靶向CD69增强子的sgRNA，并利用HACE系统对于CD69基因的增强子进行突变筛选，并找到多个重要的转录因子结合区域，如ETS/IRF, GATA, RUNX等，揭示了这些转录因子家族可对CD69基因表达产生重要影响。进一步的，在探究RUNX结合区域是如何影响CD69表达的过程中，研究人员发现HACE所筛选的单碱基突变没有强制的人工连锁，而用于验证的单碱基编辑器，由于突变存在强制的人工连锁，则在破坏RUNX结合域的同时，又引入了GATA结合区域，导致单碱基编辑在分子库筛选中大概率无法识别该重要调控区域。因此，研究人员之后采用先导编辑，完善了对HACE筛选位点的系统性验证环节。