第一作者：
齐心，梁滢，杨玉双
https://doi.org/10.1016/j.watres.2024.122682
•
碳酸氢钠构建
了微藻
胞内降解和胞外催化体系
，显著促进了
药物污染物的去除效率。
•
微藻对多西拉敏的降解效率从
41.64%
提高到
100%
，水力停留时间减少了
78.7%
。
•
胞内水解酶
（CYP97C1）
和胺氧化酶
（TynA）
是微藻高效转化多西拉敏的关键酶。
•
胞内羟基自由基和超氧自由基是多西拉敏去除的关键催化因子。
•
基于碳酸氢盐的方法可以
普遍
提高微藻对
17
种抗生素的去除效率。
与传统活性污泥法废水处理工艺相比，微藻生物治理系统不产耐药基因和二次污泥，生物质具有高经济附加价值，是国内外低碳治理药物废水（PC）的前沿热点技术。然而，如何减少微藻系统的水力停留时间是目前面临的主要瓶颈问题之一。本研究通过在微藻系统中添加5.95 mM碳酸氢盐，构建了一个意想不到的胞外化学催化/胞内生物降解的协同去除系统，在96小时内完全去除 （100%）多西拉敏（DOX），而对照组需要192小时。去除能力和质量平衡分析表明，单位微藻密度的生物降解率显著提高了207%。进一步利用转录组学、酶抑制试验和高分辨率质谱分析表明，加入碳酸氢盐代谢DOX后，水解酶（CYP97C1）和胺氧化酶（TynA）可以催化DOX生成多西拉敏N-氧化物和未知中间体（C
15
H
17
NO
2
）。同时，碳酸氢盐与微藻分泌的过氧化氢发生反应，在细胞外形成更多的氧化自由基，氧化自由基抑制试验表明，超氧自由基和羟基自由基是微藻胞外降解DOX的主要催化因子。最后，为了验证方法的普适性，我们研究了在微藻系统中添加碳酸氢盐对17种PC混合物的去除效率，结果表明去除效率提高最高提升了500.8％。因此，这项研究不仅开发了一种在较短时间内提高微藻对不同PC处理效率的方法，而且对其潜在原理提供了独特的机制见解（图1）。
图1 图示摘要
为了确定适合DOX处理的微藻菌株，我们进行了初步筛选实验。小球藻
Chlorella
sp.和
Mychonastes
sp.在相同时间内具有更高的DOX去除率（10 天内100%去除0.1 mg L
-1
DOX）。鉴于小球藻具有已知基因组序列且广泛分布于水生系统中，因此选择它进行深入研究（图2）。为了探索实现更快去除DOX的潜在解决方案，我们研究了不同浓度（即0、1.19、5.95、11.9和23.8 mM）碳酸氢盐对小球藻去除 DOX的影响。有趣的是，向微藻系统中添加5.95 mM碳酸氢盐可显著提高0.1 mg
L
-1
DOX的去除率，在4天内达到100%。
图2 不同碳酸氢钠浓度对微藻去除多西拉敏的影响
为了解析强化机制，我们首先研究了碳酸氢盐对小球藻生长的影响，因为我们怀疑增强的去除是通过更高的生物量实现的。然而，我们发现5.95 mM碳酸氢钠对微藻生物量生产的影响微乎其微。与我们的结果一致，先前的研究也发现低浓度（例如11.9或23.8 mM）的碳酸氢盐对
Desmodesmus
sp.和
Tetraselmis suecica
的生长影响不大。我们进一步计算了DOX单位细胞去除率（每
10
6
个细胞去除的DOX），我们发现相对DOX去除率从每单位藻类密度的3.42显著增加到7.09（%/10
6
个
细
胞），比不添加碳酸氢盐时高2.07倍。这些数据表明，碳酸氢盐不是通过增加生物量的产生来提高DOX的去除率。然后，我们进一步进行了质量守恒分析，以评估非生物因素、生物累积、生物吸附和生物降解对DOX总去除的贡献。生物降解过程占0.1 mg
L
-1
DOX去除率的35.92%，在添加5.95 mM碳酸氢盐后，该比例显著增加至97.09%。因此，DOX的去除主要是通过添加碳酸氢盐后增强微藻生物降解来实现的（图3）。
图3 Mass balance of doxylamine removal by microalgae
如上所示，添加碳酸氢盐主要通过增强生物降解作用改善了DOX的去除。随后，我们想要了解小球藻如何在添加碳酸氢盐的情况下转化DOX。为了确定DOX的潜在BP，本研究采用了基于HPLC-ESI-HRMS的优化非靶向分析工作流程，发现了2种降解产物（图4）。
图4 Identification of microalgal transformation production of doxylamine
为了探索导致DOX降解的潜在驱动基因，我们着手分析暴露于添加和不添加碳酸氢盐的DOX的小球藻属的整体转录组变化。我们根据以下条件确定了潜在的驱动基因：1）这些基因应编码降解酶，例如氧化酶、羧化酶和/或羟化酶，2）仅在与碳酸氢盐和DOX共同处理时才应显着上调>1.5倍（p<0.01）。相应地，我们发现在微藻培养物中添加碳酸氢盐后，tynA和CYP97C1两个基因的表达分别显著上调了4.99倍和6.55倍。TynA和CYP97C1是一级胺氧化酶和水解酶，可以催化胺功能团的氧化和/或羟基化。然后我们提出了这些酶转化DOX的途径。为了验证我们的推测，我们首先确定了CYP450的活性，结果表明，在暴露于DOX和/或碳酸氢盐的情况下，其活性逐渐增加。在微藻培养物中添加CYP97C1和TynA酶抑制剂后，DOX的去除率从100%降至44%和10%，表明CYP97C1和TynA在DOX的生物降解中起着至关重要的作用。我们还对DOX和两种酶进行了计算机分子对接，表明这些分子之间存在很强的结合。然后我们提出了生物转化途径（图5），其中BP1可以通过TynA氧化DOX的叔胺基团（-
C
2
H
6
N）形成。由于CYP97C1可以诱导BP1的氧化胺基团（-
C
2
H
6
NO）进一步羟基化，因此可以转化BP2。同时，CYP97C1直接羟基化DOX的叔胺基团（-C
2
H
6
N）也可以生成BP2。
图5 Identification of driving enzyme for microalgal transformation of doxylamine
除了由细胞内酶介导的胞内DOX降解外，DOX还可能被多种胞外因素降解，如微藻分泌的酶和活性氧（ROS）。通过过滤方式（0.22 µm滤膜），我们获得了无细胞悬浮液。首先我们对无细胞悬浮液中胞外酶进行了失活处理，发现同未被失活处理组相比，多西拉敏去除效率未有差异。这些结果表明，除了降解酶之外，其他因素也可能是导致DOX细胞外去除的原因。碳酸氢盐可以与不同的ROS发生反应，通过以下反应生成不同的氧化剂。
由于这些氧化剂能够非选择性地氧化不同的有机污染物，并可用于有效去除水中的PC，因此我们设想细胞外ROS可能有助于增强DOX去除。为了测试细胞外ROS是否有助于增强DOX去除，首先测量了藻类无细胞悬浮液中的总ROS水平。如图6所示，与未添加碳酸氢盐的相比，添加碳酸氢盐显著增加了总ROS水平，分别为492倍和181倍。一致地，在与0.1 mg
L
-1
DOX一起孵育时，添加碳酸氢盐显著降低了胞外的
H
2
O
2
水平。然后，我们测量了藻类无细胞悬浮液中特定ROS物种的浓度，包括超氧化物自由基（
O
2
•-
）、羟基自由基（HO•）和H
2
O
2
。正如预期的那样，在与0.1和10 mg
L
-1
DOX一起孵育时，添加碳酸氢盐显著增加了额外的
O
2
•-
，分别为3.64倍和1.82倍。相比之下，在相同实验条件下，额外的HO•仅略有（p>0.05）增加。随后，我们使用特异性氧化自由基清除剂来识别负责DOX细胞外降解的氧化自由基种类。实验结果表明O
2
•-
和HO•在DOX的细胞外降解中起着至关重要的作用（图6）。
图6 胞外降解机制探究
在自然条件下，微藻很少在单一碳/能源条件下生长，也就是说营养物/污染物的复杂混合物是实际是生长条件，然而，在实验环境中研究微藻对混合污染物去除效率的研究匮乏。因此，我们研究了添加碳酸氢盐对微藻去除17种PC混合物的影响，包括六种磺胺类药物（SA）、两种氟喹诺酮类药物（FQ）、三种四环素类药物（TC）、三种氯霉素（CLP）、红霉素、林可霉素和阿莫西林。与未添加碳酸氢盐的溶液相比，磺胺嘧啶、林可霉素、环丙沙星、磺胺醋酰、氟苯尼考、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、甲砜霉素、磺胺甲恶唑、氯霉素和氧氟沙星的去除率提高了26.33-500.81%（图7）。
图7 碳酸氢钠对微藻去除17种混合药物污染物的影响
这项研究表明，碳酸氢盐上调细胞内代谢酶和细胞外氧化自由基水平，导致DOX去除效率显著提高340%，处理半衰期大幅缩短78.7%。具体来说，转录组学和酶抑制验证实验证明，额外的碳酸氢盐上调了关键降解酶（如CYP97C1和TynA）的表达，从而促进羟基化和胺氧化。暴露于碳酸氢盐和DOX会显著增加细胞内ROS的产生，随后这些ROS被排泄到细胞外环境中。这些ROS与碳酸氢盐反应后，可以转化为超氧化物和羟基自由基，它们可以在细胞外增强DOX去除方面发挥协同作用。这种胞内外降解机制的解析对微藻去除抗生素机制提供了新颖的科学见解。
熊久强
，博士，中国海洋大学海洋生命学院副教授，长期致力于解析环境抗生素分布规律，阐明优先控制因子。构建高效消减典型抗生素的微藻治理和植物-微藻耦合修复系统，研发提高系统修复效率的技术手段，并阐明污染物的酶促动力学、转化途径和蓄积规律。从“效能-机制-意义”三方面深入探讨了植物-微藻耦合系统高效去除抗生素的多维调控机制。共发表文章38篇，其中第一/通讯作者发表论文26篇（影响因子>10的论文20篇），先后发表在
Water Research
，
Trends in Biotechnology
，
Journal of Hazardous Materials
，
Journal of Cleaner Production
等领域权威刊物上。近五年引用次数>3000余次，ESI高被引论文6篇，连续入选全球前2%顶尖科学家榜单。主持国家自然科学面上和青年项目，山东省高等学校“青创团结计划”。
