我们都知道，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在治疗癌症方面已取得显著的成功，目前已有六种针对不同恶性肿瘤的CAR-T细胞产品上市：①Kymriah (tisagenlecleucel);
②Yescarta (axicabtagene ciloleucel);
③Breyanzi (lisocabtagene maraleucel) ;
④Tecartus (brexucabtagene autoleucel)（靶向CD19 抗原）;
⑤Abecma (idecabtagene vicleucel) ;
⑥Carvykti (ciltacabtagene autoleucel)（靶向 B 细胞成熟抗原）。
然而，CAR-T具有其局限性，研究人员正在探索基于其他免疫细胞的疗法。其中，CAR NK细胞作为一种异体细胞疗法，提供了一种经济、安全、有效的替代方法。NK细胞表现出安全的细胞因子特征，副作用较小，并且可以从健康供体转移到患者（同种异体），从而可以作为现成产品使用。
为了改进CAR研究，加强对细胞疗法的体内监测，研究者迫切需要一种简单、可靠且多功能的CAR检测试剂。大多数现有的CAR包含一个单链可变片段（scFv），通过特定的连接子（linker）连接重链和轻链，因此，研究人员提出问题，针对这些连接子的单克隆抗体（mAbs）是否可以更广泛地检测CAR？最终结果展示，这些连接子特异性单克隆抗体可以高特异、高灵敏地检测体外不同CAR-NK细胞，为基于scFv的CAR检测提供了一种有效且通用的替代方法。
研究者首先通过流式细胞术检测了使用不同CAR构建体转导的原代NK细胞的CAR表达。比较了针对G4S连接子和Whitlow连接子的单克隆抗体（分别记为a-G4S mAb和a-Whitlow mAb）与其他常用的检测方法——抗人F(ab')2多克隆抗体、抗鼠F(ab')2多克隆抗体和重组人蛋白（rh-protein）GFP染色的检测效果（图1A）。研究结果表明，a-G4S mAb和a-Whitlow mAb能够可靠地检测所有含有Whitlow或G4S连接子的CAR-NK细胞，且与GFP表达水平相当，显示出高特异性和灵敏度（图1B）。
图1 CARNK细胞可以在体外用连接子特异性单克隆抗体进行检测
接着，研究者在体外进行功能性测试，评估了这些连接子特异性mAbs激活NK细胞的能力，证实了这些mAbs可以激活NK细胞，并且激活效果与使用rh-protein相当（图2）。
图2 NK细胞上表达的CAR功能可以在体外使用连接子特异性mAb进行评估
另外，研究人员发现，使用连接子特异性mAbs进行的磁珠分离可以显著提高CAR+ NK细胞的比例，尽管恢复率有待提高，但纯化过程并没有影响细胞的活性和杀伤功能。说明此类单抗在纯化CAR NK细胞方面也具有潜力（图3）。
图3 连接子特异性单克隆抗体可用于体外CAR NK 细胞的纯化
最后，CAR-NK 细胞未来的临床应用主要是能够在全血或瘤内可靠地检测到它们，以确定 CAR-NK 细胞计数和持久性。因此，研究人员将 CAR-NK 细胞与或不与全血或患者来源的肿瘤球体共培养 24 小时，展示了连接子特异性mAbs在全血样本和乳腺癌肿瘤球体中检测CAR -NK细胞的能力（图4）。
图4 连接子特异性mAb可用于检测全血样本及乳腺癌肿瘤球体中的CAR
NK细胞当然，尽管连接子特异性mAbs在本研究中显示出了巨大的潜力，但同样存在一些限制，比如：所使用的CAR构建体的设计可能影响连接子的可及性，从而影响抗体的结合能力。未来的研究需要考虑不同的CAR设计，以进一步验证这些mAbs作为通用CAR检测试剂的潜力。
本研究开发了一种通用、可重复的CAR检测方法，即基于scFv连接子的特异性单克隆抗体，这种方法不仅提高了检测的特异性和灵敏度，对于临床医生监测CAR-NK细胞的命运以及质量控制至关重要，而且具有成本效益，易于管理，并可能作为研究工具，有助于加快新型CAR-NK细胞疗法的开发。整体而言，本研究为CAR-NK细胞疗法的实施和临床应用提供了重要的方法学贡献，并为未来的研究和治疗监测提供了新的思路。
