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客户文章 | Cancer Cell | 如何通过单细胞转录组进行肿瘤生物标志物研究

基迪奥生物 · 公众号 · · 2024-11-07 18:07

正文

前言

肿瘤生物标志物（Tumor biomarkers）是肿瘤发生和进展过程中由身体对肿瘤的反应产生的物质 ^[1] ，在癌症的早期筛查、诊断、预后和治疗等领域都发挥着重要的作用。然而，由于肿瘤的克隆异质性和肿瘤微环境（TME）的组成复杂性，导致难以准确鉴定不同肿瘤的生物标志物。

单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术能够识别肿瘤组织中不同的细胞亚群，表征不同样品中细胞类型的频率差异、还能够识别每种细胞类型中特异激活的基因和通路、以及探究细胞之间的分化关系和相互作用等 ^[2] ；这为肿瘤生物标志物的鉴定以及精准医疗的实现提供了前所未有的机会。

下面是单细胞转录组进行生物标志物研究的工作流程：

1）首先，通过对临床研究的患者队列进行单细胞转录组测序，可以构建目标组织的单细胞图谱，识别和鉴定不同的细胞亚群。

2）其次，通过细胞频率分析和差异基因分析，可以识别不同细胞类型和基因对药物的响应，从而预测与药物相关的生物标志物。

3）进一步，可以根据疾病预后和相关生物标志物将患者分为更精细的人群，从而将疾病分为不同的亚型。

4）最后，可以针对不同疾病亚型患者对特定药物的敏感性制定个性化的治疗方案，最终实现疾病的精准诊断和治疗。

图1 单细胞转录组生物标志物研究工作流程 ^[3]

接下来，小编就以这篇基迪奥客户天津医科大学肿瘤医院姜宏景教授团队在肿瘤研究领域顶刊《Cancer Cell》上发表的最新研究论文为例，给大家讲解一下如何利用单细胞转录组寻找肿瘤生物标志物，基迪奥生物为该研究提供了10×单细胞转录组测序与分析服务。

中文题目：

新辅助帕博利珠单抗加化疗治疗可切除食管鳞状细胞癌的前瞻性研究：Keystone-001试验

英文题目：

A prospective study of neoadjuvant pembrolizumab plus chemotherapy for resectable esophageal squamous cell carcinoma: The Keystone-001 trial ^[4]

发表期刊： Cancer Cell

影响因子： 48.8

发表时间： 2024年10月14日

合作单位： 天津医科大学肿瘤医院

研究背景

食管癌是中国高发的恶性肿瘤之一，术前化放疗联合免疫检查点抑制剂（ICIs）在可切除的食管鳞状细胞癌（ESCC）中显示出治疗潜力，但现有治疗方法的复发率较高。研究旨在评估新辅助帕博利珠单抗联合化疗在III期ESCC患者中的安全性和有效性，并鉴定外周血和肿瘤组织中的免疫细胞亚群，以识别潜在的生物标志物，从而为ESCC患者提供更有效的治疗策略。

实验设计

从12名接受新辅助治疗的ESCC患者中收集了配对的外周血和肿瘤组织样本，并进行单细胞转录组测序。

图2 文章单细胞测序分析工作流程

研究思路

图3 文章整体研究思路

研究结果

细胞图谱和细胞频率分析锁定关键细胞亚群

单细胞转录组测序一共得到225,584个高质量细胞，通过聚类和注释将其划分为57个细分的细胞亚群（图4AB）。根据对新辅助治疗的反应对细胞亚群进行了统计分析和可视化（图4C），发现四个细胞亚群在统计学上存在显著差异，特别是 TRGC2 ⁺ NKT细胞（图4D）。此外，还发现TRGC2 ⁺ NKT细胞亚群的比例在受益于新辅助治疗患者的外周血中显著更高，但在肿瘤组织中则不显著（图4EF）。

图4 外周血和肿瘤组织的细胞图谱和细胞频率分析

拟时分析揭示NKT细胞的发育分化轨迹

接下来，基于关键发育基因的表达推断了所有NKT细胞亚群的分化轨迹。结果发现TRGC2 ⁺ NKT细胞位于轨迹的末端，并在那里发挥杀伤和抗原呈递作用（图5A）。 TRGC2 、 FGFBP2 和 NKG7 被鉴定为TRGC2 ⁺ NKT细胞中的关键基因（图5B）。进一步从代谢组和表观遗传组的角度识别了参与TRGC2 ⁺ NKT细胞功能的关键基因，这些基因涉及细胞周期、分裂、Wnt信号通路等过程（图5C）。这进一步支持了TRGC2 ⁺ NKT细胞在响应新辅助治疗中的关键作用。

图5 NKT细胞的拟时分析和关键基因的富集分析

再分群分析揭示TRGC2 ⁺ NKT细胞的异质性

差异基因分析和通路富集分析进一步揭示了肿瘤组织和外周血中TRGC2 ⁺ NKT细胞的功能差异（图6AB）。基于差异基因分析的结果，通过再分群分析将TRGC2 ⁺ NKT细胞分为三个功能群：原始、癌症和效应TRGC2 ⁺ NKT细胞亚群（图6C）。原始和效应TRGC2 ⁺ NKT细胞在良好反应组中的活性更高，而癌症TRGC2 ⁺ NKT 细胞在不良反应组中的表达更高（图6DE）。

图6 TRGC2 ⁺ NKT细胞的差异分析和再分群分析

拟时分析揭示TRGC2 ⁺ NKT细胞的分化关系

接下来，通过拟时分析进一步探究了外周血中三种TRGC2 ⁺ NKT细胞的演化关系。发现原始TRGC2 ⁺ NKT细胞随着拟时间的推移演变成癌症和效应TRGC2 ⁺ NKT细胞（图7AB）。肿瘤组织和外周血中的效应TRGC2 ⁺ NKT细胞亚群表现出与谱系相关的表达谱相似性，这表明它们之间存在联系（图7C）。随着拟时间的推移，趋化因子如 CCL5 和 CCL21 的表达显著增加（图7D），这表明趋化细胞因子在招募外周血TRGC2 ⁺ NKT细胞亚群进入肿瘤微环境中起着关键作用。

图7 TRGC2 ⁺ NKT细胞的拟时分析和关键基因的表达变化

共培养实验验证TRGC2 ⁺ NKT细胞在免疫治疗应答中的作用

从四名不同ESCC患者的外周血单核细胞（PBMCs）中分离出TRGC2 ⁺ NKT细胞，并与患者来源类器官（PDOs）按不同比例混合共培养（图8A）。结果发现，随着TRGC2 ⁺ NKT比例的升高，凋亡PDOs的比例进一步升高（图8B），在高比例TRGC2 ⁺ NKT组中观察到GRZMB ⁺ CD3 ⁺ T细胞的百分比增加（图8C）。同样，与TRGC2 ^- NKT相比，与TRGC2 ⁺ NKT细胞共培养后，PDOs的细胞凋亡比例明显增加（图8DEF）。

图8 TRGC2 ⁺ NKT细胞增强ESCC免疫治疗的体外验证

免疫浸润分析揭示TRG C2 ⁺ NKT细胞的生物标志物作用

最后，对数据库中ESCC患者的单细胞数据集进行了免疫浸润分析，鉴定出47个免疫细胞亚群（图9A）。在对新辅助治疗反应良好的患者中，TRGC2 ⁺ NKT的细胞比例和细胞评分高于反应不良的患者（图9BCDF）。此外，ROC曲线分析发现与传统的免疫激活标记相比TRGC2 ⁺ NKT细胞对治疗有效率的预测效果更佳（图9E）。总之，以上结果表明TRGC2 ⁺ NKT细胞可能是预测免疫治疗反应的有效生物标志物。

图9 反应良好和不良组之间TRGC2 ⁺ NKT细胞比例和评分的差异

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