基于嗅觉受体的辛香类中药陈皮、丁香和小茴香药性表达的网络药理学研究

嗅觉在人类生活的各个方面起着重要作用。人类靠嗅觉不仅可以探测到环境中的气体分子，而且能区分结构差异很小的分子 ^[1] 。嗅觉障碍则会导致营养不良、体重减轻、食物中毒等 ^[2] 。此外，许多疾病会伴随嗅觉障碍，如阿尔茨海默病和帕金森症 ^[3] 。 研究发现哺乳动物对不同气味的识别是气体分子作为配体与嗅觉神经元纤毛中表达的嗅觉受体（ olfactory receptors ， OR ）特异性结合的结果 ^[4] 。气味分子激活 OR 后，触发经典环磷酸腺苷（ cAMP ）依赖的信号级联，然后通过一系列传导通路将信号传递给大脑皮层。其中， OR 属于能编码含有 7 个跨膜结构域受体家族的 G 蛋白偶联受体 ^[5] 。每个嗅觉神经元表达一个 OR 基因类型 ^[6] 。

辛香类中药大多有浓烈的气味，其萜类和挥发油成分不仅含量丰富且在心脑血管、胃肠道系统等方面有较好的药理作用 ^[7-8] 。由此推测挥发油成分可能是辛香类中药药性表达的物质基础，且辛香类中药可能通过与 OR 相互作用来发挥药效 ^[9] 。但目前对 OR 的结构特征和生理功能仍缺乏充分的认识 ^[10] 。网络药理学是基于药物之间结构、功效等方面的相似性，通过对药物 - 靶点、靶点 - 靶点网络进行分析，从整体水平上预测药物与机体相互作用的学科 ^[11] 。目前，网络药理学已被广泛应用于中医药领域，如中药的现代药理作用机制研究和药性表达研究等 ^[12] 。因此，本研究采用网络药理学方法，对临床上常用、药效确切的 3 味辛温且具有芳香气味的中药陈皮、丁香、小茴香进行成分分析，建立辛香类中药与 OR 的相互作用网络，阐释辛香类中药成分与机体相互作用关系，以期发现辛香类中药的药效物质基础，为中药辛味的辨别提供分子水平的参考依据，从而更好地阐释中药辛味药性表达的分子机制。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库

数据库主要包括：中药系统药理学数据库与分析平台（ TCMSP ， http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php ）、 Uniport （ http://www.uniprot.org ）、 STRING 11.0 （ https://string-db.org ）、 David （ https://david.ncifcrf. gov ）。软件主要包括： Cytoscape 3.5.1 及其插件 Network Analyzer 和 CytoHubba 。

1.2 3 味辛香类中药活性成分的筛选

通过 TCMSP 数据库收集陈皮、丁香、小茴香 3 味辛香类中药的化学成分。利用口服利用度（ oral bioavailability ， OB ）、类药性（ drug likeness ， DL ）及药物半衰期（ half life ， HL ） 3 个参数筛选出每味药的活性成分，筛选阈值设定为： OB ≥ 30% ， DL ＞ 0.18 ， HL ≥ 4 。

1.3 3 味辛香类中药活性成分 - 靶点网络的构建

通过 TCMSP 等数据库收集陈皮、丁香、小茴香活性成分的潜在作用靶点。采用 Uniport 数据库对潜在作用靶点进行标准化处理，然后运用 Cytoscape 3.5.1 软件构建 3 味辛香类中药活性成分 - 靶点网络图。

1.4 3 味辛香类中药潜在作用靶点 -OR 相关蛋白互作网络图

通过 Uniport 数据库收集所有 OR 相关蛋白，再分别将所获得的 3 味辛香类中药潜在作用靶点基因和 OR 相关蛋白上传至在线 STRING 11.0 数据库，置信度蛋白质参数评分值＞ 0.9 ，然后运用 Cytoscape 3.5.1 软件构建 3 味辛香类中药的靶点 - 蛋 白相互作用网络图。使用插件 Network Analyzer 对网络进行拓扑分析，使用插件 CytoHubba 筛选出度值（ degree ）≥ 2 倍的平均节点度的基因作为关键靶点。

1.5 基因本体学 （ GO ） 功能富集分析和京都基因与基因组百科全书 （ KEGG ） 通路分析

将关键靶点输入 David 在线数据库，物种选择人种，分别进行 GO 功能注释和 KEGG 通路富集分析，探讨 3 味辛香类中药陈皮、丁香、小茴香的共同作用靶点及相关信号通路。

2 结果

2.1 3 味辛香类中药活性成分的筛选

获得陈皮主要化学成分 213 个、丁香 117 个、小茴香 45 个。根据 OB ≥ 30% ， DL ＞ 0.18 ， HL ≥ 4 阈值筛选后获得陈皮活性成分 5 个、丁香 5 个、小茴香 2 个。其中，除丁香中的山柰酚、槲皮素及异长春花苷内酰胺 3 个成分外，谷甾醇、柚皮素、 5,7- 二羟基 -2-(3- 羟基 -4- 甲氧基苯基 ) 苯并二氢吡喃 -4- 酮、二氢川陈皮素、川陈皮素、 β- 谷甾醇、豆甾醇 7 个成分均属于挥发性成分（表 1 ）。

2.2 3 味辛香类中药活性成分 - 靶点网络的构建

如图 1 所示，陈皮、丁香、小茴香活性成分的潜在作用靶点经筛选去重后得到 224 个。非挥发性成分共调控 230 个靶点，占比 58% （ 230/397 ）；挥发性成分共调控 167 个靶点，占比 42% （ 167/397 ）。挥发油中调控靶点最多的成分是 β- 谷甾醇，共调控 40 个靶点，然后依次是柚皮素（ 37 ）、川陈皮素（ 34 ）、豆甾醇（ 33 ）、 5,7- 二羟基 -2-(3- 羟基 -4- 甲氧基苯基 ) 苯并二氢吡喃 -4- 酮（ 10 ）、二氢川陈皮素（ 10 ）、豆甾醇（ 3 ）。可见，挥发油类成分是辛香类中药发挥药理作用的主要活性成分之一。

2.3 3 味辛香类中药潜在作用靶点 -OR 相关蛋白相互作用网络

通过 Uniport 数据库收集得到 OR 相关蛋白共 515 个，再将所获得的 3 味辛香类中药的所有潜在作用靶点基因和 OR 相关蛋白上传至在线 STRING 11.0 数据库，置信度蛋白质参数评分值＞ 0.9 ，然后运用 Cytoscape3.5.1 软件构建 3 味辛香类中药的靶点 -OR 蛋白相互作用网络（图 2 ）。如图 3 所示，筛去重复值后得到与 OR 相关蛋白存在相互作用的中药靶点共 85 个（陈皮 25 个、丁香 63 个、小茴香 19 个）。其中，陈皮和丁香共同作用靶点有 5 个，分别为 MAPK8 、 F2R 、 TP53 、 AR 、 PPARG ；丁香和小茴香共同作用靶点有 7 个，分别为 HTR2A 、 CHRM4 、 CHRM3 、 PRKCA 、 ADRA2A 、 ADRB2 、 CHRM2 ； 3 味中药共同作用靶点有 5 个，分别为 CASP3 、 PIK3CG 、 PRKACA 、 JUN 、 SCN5A 。其中 CASP3 通过参与半胱氨酸蛋白酶的激活级联反应执行细胞凋亡过程 ^[13] 。 PIK3CG 是磷酸肌醇激酶 - 蛋白激酶 B （ phosphatidylinositol3'-kinase- protein kinase B ， PI3K-Akt ）信号通路的重要分子，受细胞外信号激活后， Akt 可通过调节下游分子来影响细胞的生长及转化 ^[14] 。 PRKACA 属于环核苷酸依赖性蛋白激酶，是 cAMP 信号转导的主要效应器 ^[15] 。 JUN 是丝裂原活化蛋白激酶（ mitogen- activated protein kinase ， MAPK ）信号通路的一个核靶点， MAPK 是从细胞表面到细胞核的信号转导介质 ^[16] 。 SCN5A 可通过调控钠离子通道蛋白的 表达调节电压依赖性钠离子渗透性 ^[17] 。这说明陈皮、丁香、小茴香均可通过作用于这 5 个靶点所在的 cAMP 、 MAPK 等信号通路来影响细胞的生长、转化及凋亡过程。拓扑分析结果（表 2 ）表明每个基因的平均节点度为 4.34 ，因此选取度值（ degree ） ≥ 9 的 25 个基因作为关键靶点（表 3 ）。

2.4 GO 功能富集分析和 KEGG 通路分析

合并 25 个关键靶点和 17 个共同作用靶点 并保留唯一值，然后利用 David 在线数据库对其 34 个靶点进行 GO 功能富集分析，发现相关靶点主要的分子功能有 G 蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、 α ₂ - 肾上腺素能受体活性、转录调控区 DNA 结合等 7 个。 KEGG 通路分析发现 陈皮、丁香、小茴香作用于嗅觉受体后主要参与的生物过程包括平滑肌收缩的调节、凋亡过程的负调控、腺苷酸环化酶抑制 G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路等 31 个过程 ；主要涉及癌症、胆碱能突触、钙、 cAMP 等 78 个信号通路。综合比较分析发现陈皮、丁香、小茴香作用于嗅觉受体后均可通过激活细胞膜内或突触内 G 蛋白偶联乙酰胆碱等多个受体活性来 参与经典 cAMP 及其他多个信号通路（图 4 ）。

3 讨论

陈皮是芸香科植物橘 Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮，其味辛、苦，性温，归肺、脾经，是临床上常用的调理中枢气机和治疗咳嗽痰多的中药 ^[18] 。丁香属于桃金娘科植物丁香 Eugenia caryophyllata Thunb. 的干燥花蕾，其味辛，性温，归胃经、脾经、肾经 ^[19] 。小茴香属于伞形科植物茴香 Foeniculum vulgare Mill. 的干燥成熟果实，其味辛，性温，归肝经、脾经、胃经、肾经