▲共同第一作者：范圣贤、秦鸣铭
通讯作者：丛志奇
通讯单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
论文DOI：10.1021/acscatal.4c06342
（点击文末「阅读原文」，直达链接）
羟基化反应对于调节和提升甾体类化合物的生物活性及功能发挥着不可替代的作用，近年来甾体类化合物中的未活化C-H键的酶促直接羟化受到广泛关注。本研究通过过氧化氢隧道工程策略结合催化残基的引入，构建了一个高效的过氧化氢驱动的P450过加氧酶，用于甾体类化合物的区域和对映选择性羟化。
甾体类化合物在药物研发中占据至关重要的地位，羟基化反应在调节和增强其生物活性与功能方面扮演着不可或缺的角色。然而，甾体类化合物的结构复杂，其内部
C-H
键的区域选择性和对映选择性羟化一直是化学合成领域的一大挑战。
P450
酶因在甾体类化合物羟基化方面展现出的潜力，受到科研人员的持续关注。但
P450
酶的活性高度依赖价格高昂的辅因子
NAD(P)H
以及氧化还原伴侣为羟基化过程提供电子，这一现状严重限制了
P450
酶在工业领域的广泛应用。
针对
P450
酶对辅因子
NAD(P)H
以及氧化还原伴侣高度依赖的问题，本文使用本研究组开发的过氧化氢隧道工程策略
(H
2
O
2
Tunnel Engineering, HTE)
，结合引入天冬氨酸作为催化残基，将
NADH
依赖性的
CYP154C5
单加氧酶改造为可以利用廉价的
H
2
O
2
作为氧化剂的
CYP154C5
过加氧酶，进而实现对多种甾体类化合物如睾酮、诺龙、雄烯二酮等的高活性、高区域
/
对映体选择性羟化。晶体结构分析表明，
H
2
O
2
隧道工程在促进
H
2
O
2
流入活性中心方面起着至关重要的作用，并且引入的天冬氨酸残基可能充当水隧道的门控开关，帮助
H
2
O
2
进入活性中心中发挥作用。分子动力学模拟表明，突变体的引入显著增加了酶活性位点
10Å
范围内的水分子数量，同时催化残基引导着水分子到达离血红素中心更近的距离，并且将底物拉近血红素中心，使其更容易被氧化。
16α-
羟基睾酮进行毫克级制备，实现了较高的底物转化率
(> 98%)
和分离产率
(90%)
，证明其在合成应用方面的潜力。这项工作不仅为开发非天然
P450
过加氧酶建立了一种更完善可行的半理性方法，而且为羟基甾体类化合物的酶促合成提供了一种潜在的实用方法。
图
1.
报道了
A
）
H
2
O
2
隧道工程和
B
）引入催化残基将
P450
单加氧酶转化为过氧化物酶的两种策略。
C
）将二合一，设计一种用于类固醇羟基化的非天然
P450
过氧化物酶。
首先，研究团队采用
H
2
O
2
隧道工程策略对
CYP154C5
进行半理性设计。使用
CAVER WEB(https://los chmidt . chemi . muni . cz/CAVER WEB/)
预测
CYP154C5
连接活性中心与溶剂环境的水通道，并选择了其中四条较短、有明显瓶颈的
4
条隧道作为研究对象。将这些隧道瓶颈或入口处的氨基酸残基改造为具有较小
/
极性侧链的氨基酸，并将优势突变体进行组合突变，最终得到三突变
F92A/R114A/E282A
，其过加氧酶活性提升为野生型的
8.3
倍。
图
2. A
）以
Heme
为起点，使用
CAVER1.2
预测
CYP154C5
中的所有水隧道；
B
）选定的隧道（
T1-T4
）及其瓶颈
/
入口氨基酸残基；
C
）通过
H2O2
隧道工程策略对
CYP154C5
进行蛋白质工程，用于睾酮的羟基化，转化率通过
HPLC
的睾酮峰面积计算；
D
）
WT
和
CYP154C5
突变体催化的羟基化反应的
HPLC
色谱图。反应条件：睾酮（
200μM
）、酶（
1μM
）和
H2O2
（
60mM
）在
pH 8.0
的
PBS
缓冲液中于
30℃
下反应
1
小时。
为了进一步提高过加氧酶活性，通过定点突变在血红素上方引入催化残基。有研究表明，将血红素上方高度保守的苏氨酸突变为谷氨酸可以为激活
H
2
O
2
提供一般的酸碱催化剂，从而将
P450
单加氧酶转化为过加氧酶。因此，以三突变体
F92A/R114A/E282A (AAA)
作为父本，进行
T248
的饱和突变。
AAA/T248E
的转换数
(TON: 389)
比
AAA (TON: 180)
提高了
2
倍以上，
AAA/T248G
的
TON
达到
665
，是
AAA
的
3.7
倍，而四突变
AAA/T248D
表现出最高的催化
TON
为
953
，表明天冬氨酸比谷氨酸更好地在
H
2
O
2
的活化中发挥催化残基的作用。
随后，研究团队在不同
H
2
O
2
浓度下对
WT
和优势突变体进行了活性测定。在所有
H
2
O
2
浓度水平下，突变体与野生型相比均提高了睾酮羟基化的
TON
。此外，所有酶的催化活性都随着
H
2
O
2
浓度的增加而增加。值得注意的是，
H
2
O
2
隧道工程策略产生的三种突变体
F92A
、
AAA
和
AAA/T248D
在较低
H
2
O
2
浓度
(60-80mM)
下产生最佳
TON
，说明使用
HTE
策略降低工程
P450
过加氧酶中使用的
H
2
O
2
浓度是可行的。最重要的是，突变体
AAA/T248D
在所有条件下都表现出最好的
TON
，强烈表明了组合两种策略的积极效果。
图
3. A
）保守苏氨酸在睾酮结合
CYP154C5
（
PDB 4j6d
）晶体结构中的位置；
B
）在
pH 8.0
的
PBS
缓冲液中，在
30℃
下，在
H2O2
（
60 mM
）的存在下，四重突变体
AAA/T248X
（
1μM
）催化睾酮（
1 mM
）羟基化
1
小时。
C
）在
pH 8.0
的
PBS
缓冲液中，不同突变体在不同浓度的
H2O2
下在
30℃
下催化睾酮（
1 mM
）羟基化
1
小时。
WT
、
F92A
和
AAA
的浓度为
1μM
，
T248D
和
AAA/T248D
的浓度为
0.5μM
。
为了深入了解优势突变体的催化性能，研究团队表征了
WT
和优势突变体的动力学参数。在
H
2
O
2
的情况下，所有的突变体
Km
均下降，同时，它们的
kcat
值增加了
2.7-16.3
倍，从而导致催化性能
(kcat/Km)
比
WT
提高了
44-380
倍。此外，与
AAA
和
T248D
相比，
AAA/ T248D
分别显示出
7.6
倍和
2.5
倍的
kcat/Km
值增强，表明通过
HTE
的组合策略和引入催化残基策略提高过氧化酶活性的协同效应。对睾酮而言，
AAA/T248D
的
Km
值最低
(5.2×10
6
M)
，表明其底物亲和力高。此外，在
AAA/T248D
中引入
T248D
显著提高了其
kcat
值，从而达到睾酮羟基化的最佳
kcat/Km
值。
AAA/T248D
对睾酮羟基化的催化效率远远超过了大多数报道的天然和工程单加氧酶和过加氧酶，并且对
16α-
羟基睾酮的形成表现出
99%
的选择性，这些结果表明
AAA/T248D
是迄今为止用于睾酮羟基化的最有效的过加氧酶。
AAA/T248D
对睾酮
16α-
羟基化的高度特异性进一步增加了其作为实际生物催化剂的潜力。
表
1. WT
和典型突变体关于
H
2
O
2
和睾酮的动力学参数以及睾酮的解离常数（
Kd
）。
为了理解过加氧酶活性增强的机理，我们解析了
AAA/T248G
和
AAA/T248D
结合睾酮的晶体结构。在
AAA/ T248G
的结构中，在
F92A
和
T248G
处观察到两个新的加宽的水隧道，它们在血红素中心上方与底物通道汇合，多个
H2O
分子从入口到底物袋分布在两个通道中，表明
H
2
O
2
进入
AAA/T248G
活性位点的可能性增加。并且在
T248G
附近发现了更靠近活性位点的
H
2
O
分子
(W1)
，这个
H2O
分子与底物和几个氨基酸残基形成氢键，进一步稳定了底物的构象，表明
AAA/T248G
催化活性的提高可能归因于
H
2
O
2
可及性的提高。此外，值得注意的是，多个连续的水分子与
E247
形成氢键网络
(
图
4C)
，这使得
E247
可以作为
H
2
O
2
活化的潜在酸碱催化基团。在
AAA/T248D
的结构中，除了经由
F92A
的一个相似的通道外，另一个由
D248
门控，
D248
在帮助
H
2
O
2
进入活性中心中发挥作用，并且
D248
的侧链羧基和血红素的铁原子之间的距离仅为
4.1
Å
有助于
H
2
O
2
活化并增强
AAA/T248D
的催化活性。此外，
T248D
对增强活性的贡献还来自其与睾酮的羟基官能团的相互作用
(
图
4F)
。
D248
的羧基与睾酮的羟基形成氢键，距离分别仅为
2.9
Å
和
3.3
Å
，稳定了睾酮的结合构象，进一步增强了酶的特异性和催化效率。
图
4. A
）
AAA/T248G
的活性位点。配体和关键残基表示为棒状模型，水分子绘制为红色球体，
1.0σ
处的
2mFo-DFc
电子密度图显示为蓝色网格。
B
）在
G248
和
A92
位点附近形成的
AAA/T248G
新隧道内
H
2
O
分子的分布。
C
）氢键网络由残基
E247
、
G248
、睾酮和水分子组成。
D
）
AAA/T248D
的活性位点。配体和关键残基表示为棒状模型，水分子绘制为红色球体，
1.0σ
处的
2Fo-Fc
电子密度图显示为蓝色网格。
E
）通过
A92
和
D248
位点形成的
AAA/T248D
新隧道内
H2O
分子的分布。通过
D248
的假定水隧道用虚线标记。
F
）活性位点残基
D248
、底物、辅因子和水分子之间的关键相互作用。
G
）
H
2
O
分子在
WT
（橙色球）、
AAA/T248G
（绿色球）和
AAA/T248D
（青色球）中
114
和
282
个位点附近的分布。
H
）从
WT
改造而来的四条隧道用黄色标记。
F92A
和
T248G
附近的
AAA/T248G
新隧道以绿色标记。
F92A
和
T248G
附近的
AAA/T248D
新隧道用青色标记。
I
）睾酮在
AAA/T248D
（青色）、
AAA/T248G
（绿色）和
WT
（橙色）中的结合状态。
在探索突变对酶内
H
2
O
2
分子流动的影响的过程中，考虑到
H
2
O
2
和
H
2
O
相似的物理和化学性质，以
H
2
O
代替
H
2
O
2
，对
WT
和
AAA/T248D
在睾酮存在下进行了
100 ns
全原子模拟。与
WT
相比，
AAA/ T248D
系统中突变的引入显著增加了酶活性位点
10
Å
范围内的水分子数量。在突变位点
D248
处，观察到野生型和突变型之间的明显差异。在
WT
中，
T248
的存在起到了屏障的作用，阻止了大多数水分子向血红素中心前进
(
图
5C)
。而突变为天冬氨酸后，较长的极性侧链引导大量水分子进入活性中心
(
图
5E)
。同时，
W4
也足够靠近
T248D
处的羧基，表明位于该位置的
H
2
O
2
容易被
T248D
直接活化。此外，
D248
侧链上的氧原子与底物
C17
上的羟基相互作用，使底物比
WT
更靠近血红素中心，进而更容易被氧化
(
图
5E)
。
图
5. WT
（
A
）和
AAA/T248D
（
B
）的水分子流动分析；
WT
（
C
）和
AAA/T248D
（
D
）中
92
和
248
位点附近的水分子流动分析。
AAA/T248D
（
E
）和
AAA/T248G
（
F
）的活性位点。
为了探索
CYP154C5
过加氧酶的底物范围，检测了由
WT
和突变体
AAA/T248D
催化的诺龙、雄烯二酮和孕酮的
H
2
O
2
依赖性羟基化
(
方案
1)
。对于所有底物，
AAA/T248D
的催化性能均超过
WT
，
TON
提高了约
10-40
倍。
AAA/T248D
催化诺龙的
TON
达到
960
，几乎是
WT
的
30
倍。
WT
对雄烯二酮几乎没有活性，而
AAA/T248D
表现出显著的催化能力，产生单一产物
16α-
羟基雄烯二酮，
TON
为
287
。值得注意的是，在孕酮催化过程中，
AAA/T248D
产生了两种不同的羟基化产物，
16α-
羟基孕酮
(4b)
和
21
羟基孕酮
(4c)
，这可能是由于
F92A
位点的引入，导致其与底物
BC
环的疏水相互作用减弱，使
C21
更接近血红素铁，从而形成第二种产物。对这些催化细微差别的探索强调了酶
-
底物相互作用的动态性质和影响催化结果的多方面因素。
方案
1.
在
pH 8.0
的
PBS
缓冲液中，在
H
2
O
2
（
60 mM
）的存在下，
WT
或
AAA/T248D
（
1 μM
）催化甾体类化合物（
1 mM
）的羟基化。
最后，研究团队使用最佳突变体
AAA/T248D
进行了
16α-
羟基睾酮的半制备规模合成。在
30℃
下，在
AAA/T248D (1μM)
存在下，用
1 mM
睾酮和
30 mM H
2
O
2
在
100mL pH 8.0 PBS
缓冲液中进行反应。每小时加入酶
(1μM)
，睾酮的消耗在
3
小时内达到
> 98%
。纯化后，以
90%
的分离产率获得
16α-
羟基睾酮
(27.3 mg)
。这一结果表明了工程
P450
过加氧酶在制备羟基化类固醇中的潜力。
结合
H
2
O
2
隧道工程策略与催化残基的引入，显著提高了
CYP154C5
的过加氧酶活性，并拓宽了
CYP154C5
的底物范围。通过晶体学分析及分子动力学模拟研究，发现隧道残基的变化使得更多的
H
2
O
2
