昨天咱们探讨了重庆医科大学发表的一篇影响因子高达16.7 分的文章，今天就让我们深入剖析一下，这篇文章究竟是以怎样的思路孕育而生的（
所有的科研文献，追根溯源，本质上都是 “假设→验证→假设迭代” 这一过程的产物，不清楚的可以去看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）：
这篇文章最初聚焦于脑部缺血再灌注损伤（CIRI）对细胞产生的影响。研究团队借助体外模型发现，CIRI 发生后，细胞内会出现活性氧（ROS）累积等一系列现象（
这就是通过归纳法将ROS的产生与CIRI联系了起来，两者的联系，就是接下去他们进一步提出假设的起点，归纳法也就是通过归纳总结，为假设提出奠定基础的关键，不清楚归纳法的话，可以去看看《列文虎克读文献》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）。
与此同时，另一篇文献指出，在心脏缺血再灌注损伤中，动力相关蛋白 1（Drp1）的激活引发线粒体过度分裂，是导致 ROS 累积的关键因素。
基于此，该研究团队对 CIRI 发生后 Drp1 的激活情况以及线粒体的变化展开分析。同时，他们验证了敲减 Drp1 对 CIRI 后 ROS 水平恢复的作用（
实际上，这就是简单的柯霍氏法则验证，通过去除可能的影响分子Drp1，来查看下游可能影响的ROS水平的表型，不清楚柯霍氏法则的话，可以看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》
）。
其实，上述步骤是通过借鉴同类文献的研究成果，提出了一个相似的假设并加以验证（
假设的提出和假设的迭代，就是基于已有研究，或者基于前一个假设的实验验证结果，总结之后提出的，假设的提出和假设的迭代，对于一篇文章或者一个课题的推进而言，是必不可少的，不清楚假设或者假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）。原本的研究是针对心肌缺血再灌注损伤，而他们巧妙地将该研究机制迁移至脑部缺血再灌注损伤的研究中。
既然发现 Drp1 在 CIRI 后被激活，那么就不得不考虑 Drp1 自身的功能。另一篇文献表明，Drp1 的功能是激活线粒体分裂，进而引发线粒体自噬。
确实，在 CIRI 发生后，线粒体与 P62 的共定位情况发生了改变（
倘若你还记得线粒体自噬的相关知识，就会明白 P62 与线粒体共定位的意义，当线粒体产生损伤后，p62就会结合线粒体，并将损伤的线粒体包裹进入自噬体，从而引发线粒体自噬，相关内容在《信号通路是什么鬼？》系列自噬和线粒体自噬相关的章节中有详细讲解
）。
P62 通过与 LC - 3 结合形成自噬体，将受损的线粒体包裹起来，启动线粒体自噬过程。
而这一过程可被 Drp1 的敲减所逆转，这意味着 Drp1 的激活促使分裂后的线粒体进入自噬体（
也就是被含有LC3的自噬体膜包裹后形成的自噬体，当自噬体包裹了损伤的线粒体后，再通过结合溶酶体，则能导致损伤线粒体的降解，从而清除损伤线粒体，不清楚这一过程的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的自噬那几章复习下
）。
随着实验结果的逐步呈现，文章的研究方向也经历了进一步的假设迭代。研究重点从最初的 Drp1 激活引发 ROS 累积，转向了 Drp1 激活后引发线粒体自噬这一方向。
此处的假设迭代依旧是受其他类似研究文献的启发，但后续的研究则有所不同。研究团队开展了简单的自噬相关实验，即采用 mRFP - GFP - LC3（
如果你看过《夏老师带你读文献》，应该记得在讲解自噬实验图时提及过此类实验，这个实验的主要验证原理就是，当自噬体与溶酶体结合时，会发出红色荧光。通常会使用 mCherry，而在此实验中使用的是 mRFP，同样发出红光
）。
这个实验成为了文章假设迭代的另一个关键转折点。通过该实验，研究团队发现 Drp1 虽然激活了线粒体自噬，但并未促进自噬体与溶酶体的结合。也就是说，自噬体未能被降解，线粒体自噬过程被阻滞。
一般而言，多数文献进行到这一步，往往会将线粒体自噬阻滞作为一种研究机制而告终。然而，这篇影响因子16.7分的文章却以此现象为契机，进行了更进一步的假设迭代（
这里他们把原有的假设，进一步迭代成了“为何会出现溶酶体与自噬体无法结合的情况？”，可以看得出来，这篇文章的研究方向已经通过不断地假设迭代发生了质的改变，这就是假设迭代造成的，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）有文献表明，受体相互作用蛋白 1（RIP1）和受体相互作用蛋白 3（RIP3）可能参与了溶酶体与自噬体的结合过程。
于是，研究团队的假设迭代为：Drp1 可能通过激活 RIP1/RIP3
（
RIP1/RIP3大家应该也比较熟悉了，这俩蛋白和坏死性凋亡信号通路也密切相关，不清楚的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列中的坏死性凋亡那几章，复习下
）
，抑制了溶酶体与自噬体的结合过程。随后，他们展开了验证工作。为了对比 Drp1 激活与未激活两种状态，他们采用了对 Drp1 氨基酸进行突变的方法。将磷酸化位点突变为丙氨酸后，Drp1 将丧失磷酸化能力。通过这一方法，他们验证了 Drp1 能够激活 RIP1/RIP3，并促进 RIP1 与 RIP3 的结合。
这一步的验证是基于实验结果提出的假设迭代。实验发现 Drp1 影响线粒体自噬的关键在于阻碍自噬体与溶酶体的结合，而造成这一现象的原因很可能与 RIP1/RIP3 有关。研究团队依据这些线索，提出新的假设并进行验证。
到这一步，研究看似已较为完整，但研究团队并未止步，而是再次进行了假设迭代，这一步的思路十分巧妙。既然自噬体与溶酶体的结合受到抑制，那么这些被阻滞的自噬体膜结构会有怎样的归宿呢？研究团队首先联想到外泌体的形成，于是进一步迭代了假设。这一步的假设迭代同样建立在实验结果的基础之上。
通过验证，他们发现 CIRI 激活 Drp1 后导致的自噬阻滞所形成的自噬体，确实会转化为外泌体排出细胞，他们利用标记的 P62 证实了这一结果。
那么，累积的自噬体形成外泌体后，这些多余的外泌体是否会产生其他影响呢？研究团队再次进行假设迭代，分析了外泌体的组成成分，并收集这些外泌体，研究其对细胞的影响。
研究发现，Drp1 激活形成的线粒体自噬体累积所产生的外泌体，会激发炎症相关因子的表达，进而进一步促进 RIP1/RIP3 的激活（
这一过程可参考坏死性凋亡信号通路，相关内容在《信号通路是什么鬼？》系列中有详细讲解
），形成了一个正反馈循环。
尽管这篇文章的影响因子为 16.7 分，但它的研究思路以及假设迭代过程十分流畅。通过参考已有文献和实验结果，不断迭代原有假设，推动研究进展，这才是科研应有的模样。
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