导 读 ： 脂质纳米颗粒(L NP) 已成为一种非常有价值的 mRNA 递送平台。目前大多数 LNP 配方都遵循已批准新冠临床产品中使用的脂质比例。 然而，为拓展 mRNA 的应用领域，越来越多的研究开 始关注于 LNP 的改善，包括可电离脂质的设计筛选，脂质配方的调整，以及使用主动靶向策略来调节 LNP 的生物分布等。

2024 年 11 月， 特拉维夫大学（ Tel Aviv ）专注于核酸靶向递送的 Dan Peer 实验室 在 Advanced Science 发表研究型 文章，披露了一种磷脂含量增加的新型 LNP ，简称为 30-n-LNP 。与基准 LNP 制剂相比， 30-n-LNP 中含有 30% 二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC) ，在静脉内给药后耐受性良好，并且在携带葡聚糖硫酸钠 (DSS)- 结肠炎的小鼠模型中显示出对发炎结肠的自然靶向，同时靶向了肝脏和脾脏等清除器官。 此外，文章在改良 LNP 中包封编码白细胞介素 10(IL-10) 的 mRNA 后，结果显示结肠炎小鼠的病理负担减轻。 作者称该制剂可以作为治疗炎症性肠道疾病的 mRNA 递送系统。 今天，由菌菌带大家一起走进这篇通过微调 LNP 组分改变其靶向的研究成果

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炎症性肠病概述

炎症性肠病 (IBD) 是影响全球近 70 万人的胃肠道慢性病症，目前尚无明确的致病机制，报道的诱因有遗传易感性、免疫功能障碍、肠道微生物群改变，以及环境因素等。 IBD 通常根据它们在胃肠道中的定位以及组织炎症和损伤的深度分为克罗恩病或溃疡性结肠炎，症状包括肠道出血、长期纤维化、腹痛和腹泻。同时， IBD 也被认为是结直肠癌发展的主要风险，现有的 IBD 的治疗基于传统的抗炎和免疫抑制，以及应用于免疫信号通路调节的单克隆抗体和小分子。然而，这些方法都不具备可治愈性，而且它们通常会随着时间的推移而失去疗效，患者的生活质量不高且慢性不适，并需持续服药。

在 IBD 涉及的众多细胞因子中， IL-10 所传导的功能障碍被认为是 IBD 发展的主要因素。 IL-10 可以通过下调促炎细胞和促进肠道免疫抑制性 T _reg 淋巴细胞的分化来减少肠道炎症。 目前，直接全身给药 IL-10 在患者身上已显示出一些疗效。但是，这种方法需要使用大量蛋白质，并且会带来 IFNγ 的增加、贫血和血小板减少症等副作用。因此， 利用 LNP 技术将编码 IL-10 的 mRNA 递送到发炎的肠道组织， 不失为治疗 肠道免疫稳态和阻碍 IBD 症状的新可能。

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LNP的设计与表征

作者 参照 新冠疫苗中各 LNP 脂质摩尔比 制备得到 “ 基准 ”LNP (b-LNP) ， 具体比例为 50% 可电离脂质、 38.5% 胆固醇、 10% 辅助脂质和 1.5% 聚乙二醇化脂质。将辅助脂质 DSPC 比例 增加至 20% 和 30% ， 得到 20-n-LNP 和 30-n-LNP 两种新的 LNP 配方 。 文章中作者使用的模型内容物为荧光素酶 mRNA(Luciferase mRNA, mLuc) ，并且 选用 Lipid-15 作为可电离的氨基脂质。 结果显示，虽然 所有 LNP 均显示为外层致密的球状 （图 1D ） 、 带轻微负电荷， LNP 制剂的核酸包封效果 均 良好，且琼脂糖凝胶电泳显示 mRNA 没有发生泄露 。但相比而言， b-LNP 的粒径明显大于新的 LNP ， 均匀性也更差 （图 1B ）。 此外，文章还披露了 LNP 在多种细胞系中都具有良好的耐受性且在 4°C 存储稳定。

图 1 LNP 的设计与表征

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LNP在小鼠体内的生物分布

作者分别在健康或 DSS 荷结肠炎小鼠上进行了 LNP 的体内递送测试，在每只小鼠上按照 10μg mRNA 的剂量分别静脉注射 3 种 LNP-mRNA 。 6 小时后，处死小鼠收集器官进行分析。 通过测量发现， mLuc-20-n-LNP 和 mLuc-30-n-LNP 显示出比 b-LNP 更强的荧光强度，而且健康动物的结肠积累更高 （图 2B ）。在健康小鼠中，与 mLuc-b-LNP 相比， mLuc-30-n-LNP 的小鼠肝脏转染显著减少，而 DSS 小鼠的肝脏转染没有显著减少（图 2D ）。同时，与 mLuc-b-LNP 相比，观察到 mLuc-30-n-LNP 的脾脏摄取减少（图 2E ）。作者为了确保上述结果是由 LNP 组分比例所致而与阳离子脂质无关，还用市售脂质 SM-102 制备得到了 SM-102-b-LNP 和 SM-102-30-n-LNP 两种制剂进行对比，结果也观察到了相似的实验结果。 基于上述实验，作者认为改良配比的 LNP 制剂，尤其是 30-n-LNP 在一定程度上具有天然的结肠嗜性，尤其是在炎症条件下。 因此，作者选择了用 30-n-LNP 作为进一步测试的主要配方。

图 2 结肠炎小鼠的生物分布研究

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体内细胞对LNP的摄取

接下来，作者检查了细胞在特定器官内摄取 LNP 的情况。在实验中向携带 DSS 结肠炎的小鼠静脉注射 20μg Cre mRNA ( mCre ) 剂量的 LNP 制剂，并在注射后 48h 处死小鼠，收获细胞并用流式进行分析。 如图 3 所示， 结肠固有层中的 LNP 主要转染免疫细胞。另外，骨髓细胞的表达也证实了炎症对这些新 LNP s 转染的贡献。 而在肝脏的观察中，作者发现 mCre-30-n-LNP 避免了肝脏的摄取和循环清除。 同样，对脾免疫群体的分析也揭示了 mCre-30-n-LNP 转染极少的髓系细胞 ( CD11b ⁺ ) 和树突状细胞 ( CD11b ⁺ ， CD11c ⁺ ) 和巨噬细胞 ( CD11b ⁺ F4/80 ⁺ ) 。这证实了 30-n-LNP 具有逃避吞噬细胞摄取的能力，而且还能够逃避淋巴细胞的摄取。最后，肠系膜淋巴结在髓系膜群体中表现出与脾脏相似的模式。 这些结果阐明了 30-n-LNP 选择性转染发炎结肠的机制是由浸润的髓系细胞在结肠中的积累驱动的， 还可以 避免被肝脏、脾脏甚至肠系膜淋巴结中的单核吞噬细胞摄取。

图 3 不同脏器细胞对 LNP 的摄取情况

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n-LNP递送IL-10 mRNA的疗效

为了测试 LNP 制剂递送治疗性 mRNA 的效果，文章进一步将小鼠 IL-10 mRNA ( mIL-10 ) 包封在不同 LNP 中。在 DSS 暴露开始后的第 3/5/7 天，分别在眼眶后注射 20μg LNP ，并于第 8 天处死小鼠后进行分析。如图 4B 所示， 与对照组 mIL-10-b-LNP 相比，接受 mIL-10-30-n-LNP 治疗后的小鼠在保留结肠长度上显示出了显著的益处。 另外，如图 4C 中的组织切片结果所示， 用 mIL-10-b-LNP 处理的结肠炎动物显示出广泛的上皮损伤，屏障完整性受损等多种高水平的白细胞积累现象。而且， mIL-10-30-n-LNP 也显示出了部分保护结肠完整性的能力，具体为保留了大部分上皮完整性和隐窝结构，并减少免疫细胞浸润到固有层。 在关键细胞因子的表达中，接受 mIL-10-30-n-LNP 治疗的小鼠显著降低了体内肿瘤坏死因子 α ( TNF-α ) 、 IL-6 、炎性细胞因子 IL-12 和 IL-23 的浓度（图 4F ）。 这些结果都表明， mIL-10-30-n-LNP 可以对小鼠结肠发挥保护作用，防止 DSS 诱导的组织损伤和炎症。

图 4 递送 mIL-10 的改良 LNP 制剂对结肠炎小鼠有疗效

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LNP的体内安全性

为了评估 b-LNP 和 30-n-LNP 的体内安全性，文章在小鼠给药后对其血浆进行了 ELISA 测量，监测 TNF-α 和 IL-6 的水平。如图 5A 所示，与对照组 LPS 相比，两种改良 LNP 制剂引发的细胞因子水平较低，而且 IL-6 含量低于 LPS 组 10 倍，并且静脉注射后 2 小时没有任何 TNF-α （图 5B ）。 注射后 24 小时， IL-6 水平则降低至正常水平。同时，根据生化标志物检测结果（图 5C-F ）， LNP 制剂均未导致血液中总胆红素 、 白蛋白、肌酐和尿素水平发生显著变化。 最后，根据组织学评估结果（图