堪称完美的实验设计：食管癌前病变基因组研究

研究背景

Barrett's Esophagus（BE）在发生体细胞突变后，可能增加进展为食管腺癌 （ESAD） 的风险。在 ESAD 中经常检测到基因组特征，其中一些事件可以在 ESAD 诊断前数年检测到。因此，研究团队对 BE 进行了一项大规模的深度全基因组测序 （WGS） 研究，详细地解析BE进展为ESAD的基因组突变过程和复杂的结构变异特征。

研究方法

• 患者和样本：对在没有内窥镜治疗干预（例如 消融、粘膜切除术）的 BE 患者进行多区域、注释清晰、纯化的内窥镜活检。每个患者进行多个时间段取样分析，共有 80 名患者的 340 个病变样本和配对的 87 例正常对照样本。患者分为两组， 40 名从未进展为 ESAD 的稳定 BE 对照与 40 名进展为早期内窥镜检测到的新发癌症的病例进行比较。从取样上看，该研究的实验设计称得上是非常完美的。

• WGS测序：使用的是 Illumina HiseqX 测序平台，双端测序，读长 150bp。除了WGS 测序，还用了 SNP 芯片数据，分析体细胞水平的染色体变异（拷贝数变异和cnLOH）。

• 数据处理：WGS数据先进行常规处理，如BWA比对到参考基因组 GRCh37，然后用 Picard 进行去重复以及GATK流程进行BQSR。体细胞SNV突变使用3个软件Mutect、Strelka、LoFreq，Indel 基于Strelka。且突变位点需要至少在2个算法中call到才会纳入后续分析，突变注释用SNPEff。拷贝数变异是基于 SNP芯片数据和WGS数据，分别用pASCAT和 TITAN、 JaBbA进行分析，同时评估样品的纯度和基因组倍性，结构变异基于Crest、Delly、BreakDancer，并使用 bedtools 进行注释。

  

• 高级分析：基于突变结果，进行突变负荷、突变特征、系统发育分析等

研究结果

• 样本分为两组：40 例进展为 ESAD（Cancer Outcome，CO）的 BE 病例和 40 例未进展为 ESAD（Non-Cancer Outcome，NCO）的 BE 病例。在 NCO 和 CO 中，癌前组织每次活检的全基因组数据都检测到了较高的体细胞 SNV + InDel突变，但CO组突变负荷显著较高（Fig2ab）。且CO的每一个患者的多个样本共享的突变更多（Fig2cd）。在突变特征分析的结果中，NCO 和 CO 组没有显示出差异（Fig2efg）。

• ESAD的体细胞突变和癌前样本突变选择：研究团队基于以往多项研究结果，整理了 127 个 ESAD相关基因，其中 15 个基因 （11.8%） 在 CO 中发生显著更频繁的改变 （FDR < = 0.1），包括 TP53、APC、CDK12、ERBB2、PCDH17 和 GATA6，还有 3 个基因在 NCO 中发生更高的改变频率 （C6orf118、CDKN2A 和 AGBL4） （Fig3a）。CO 组每例患者的 ESAD 的突变基因数更高（Fig3b）。在 20 名 NCO 和 27 名 CO 患者的 24 个 ESAD 基因中发现了趋同进化的证据（来自单个患者的不同样本中同一基因的多个功能突变），其中 6 名 NCO 和 8 名 CO 患者在同一基因中具有 3 个或更多功能突变，这表明突变的选择大多与进展为 ESAD 无关（Fig3d-g）。这些数据反驳了正向选择的突变总是表明癌症促进过程的假设，并表明许多假定的癌症“驱动”基因可能被选择为不一定会导致癌症的特性。

• CO 组中的选择性突变基因：基于SNV和InDel 突变基因所在的通路分析显示， “Presenilin action in Notch and WNT signaling pathway” 在 CO 中每个患者的突变明显更多（FigS4b），研究推断认为该通路中基因改变 （如 APC 、 JUN、 CREBBP 、 MYC 和 CTNNB1） 在 ESAD 进展中具有潜在作用。