溶瘤病毒综述（一）：溶瘤病毒的抗肿瘤活性

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肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用越来越明确，操纵宿主免疫作为一种治疗概念现已得到证实。尤其是阻断CTLA4和PD-1与PD-L1通路的免疫检查点抑制剂能够解除对T细胞的抑制，并显现出对抗各种肿瘤的活性。已有实验表明，同时靶向CTLA4和PD1的联合免疫治疗能够提高黑色素瘤患者的应答率，但值得注意的是，联合治疗增加了免疫相关副作用并带来更高的成本。此外，对这些患者的长期随访发现，三年总生存率差异很小(联合治疗为58 %，单独使用nivolmab为52 % )。基于这个结果，人们对免疫治疗临床试验中依赖早期临床终点来确定治疗效果感到担忧。研究者开始关注研究新的联合治疗方案，以期通过没有重叠毒性的补充药物提高临床效果，如免疫检查点抑制剂与溶瘤病毒的联合使用。

有效的免疫治疗依赖于在肿瘤微环境中的免疫反应。拥有更高肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）密度的患者更可能对免疫治疗具有反应。然而，TIL的存在对于消灭肿瘤细胞来说是必要却并不足够的，消灭肿瘤还需要对肿瘤相关抗原的识别及有效的细胞毒性功能。肿瘤微环境中的肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间的相互作用产生了独特的免疫景象，亦即含有TIL的免疫浸润区域；完全没有免疫细胞的免疫沙漠区域；及处于中间的免疫排斥区域。免疫治疗的目的是为了将TIL招募到淋巴细胞缺陷部位，解除对免疫功能的抑制。抑制通常通过局部免疫反调节通路发生，并由抑制免疫淋巴细胞功能的调节性T ( Treg )细胞和髓源抑制细胞等细胞类型进行。

溶瘤病毒是治疗癌症的高度通用平台。溶瘤病毒的抗肿瘤活性涉及多种机制，包括病毒、肿瘤细胞和免疫系统之间固有的相互作用。病毒进化出了逃避免疫系统及与其相互作用的复杂机制，这些机制可以被用于诱导宿主抗肿瘤免疫。此外，将溶瘤病毒局部注射到单个肿瘤部位可以诱导远隔效应，在这种效应中，远端未被感染的肿瘤也经历免疫介导的排斥。这种远隔效应通过溶瘤病毒的分阶段活动发生，溶瘤病毒首先在肿瘤细胞中的选择性复制，诱导免疫原性细胞死亡，导致抗原和危险因子的释放，从而引致固有和适应性抗肿瘤免疫反应。此外，溶瘤病毒可以通过基因工程改造来表达治疗基因，从而进一步增强抗肿瘤活性。在没有病毒复制的情况下，病毒编码基因的表达能够进行抗肿瘤免疫调节，同时限制抗病毒免疫反应。因此，溶瘤病毒是高度灵活的药物，它提供了关键的开关，促进TIL进入肿瘤及激发肿瘤细胞特异性免疫。溶瘤病毒可用于增强抗原特异性免疫反应，并作为联合免疫治疗的组成部分。

在这篇综述中，我们描述了溶瘤病毒的特性如何被用来增强抗肿瘤免疫。此外，我们讨论了溶瘤病毒的治疗效果如何取决于抗病毒和抗肿瘤免疫之间的平衡，并探讨溶瘤病毒如何被定位为联合免疫疗法的基础。

溶瘤病毒作为癌症治疗药物具有许多优点，它影响癌症免疫周期的几个关键步骤。这些优点包括在肿瘤细胞中的选择性复制、诱导免疫原性细胞死亡和释放可溶性抗原和危险信号、通过招募未成熟树突细胞( DCs )和固有淋巴细胞引发固有免疫反应、纠正抗原处理和呈递中的缺陷以及激活适应性免疫反应。虽然溶瘤病毒如何纠正这些过程的分子和细胞细节还未被完全了解，但在利用溶瘤病毒产生抗肿瘤免疫方面研究者已有所进展，并基于溶瘤病毒的组合疗法提出了见解。

溶瘤病毒介导抗肿瘤活性的机制

在肿瘤细胞中的选择性复制。肿瘤趋向性(病毒选择性在肿瘤细胞中而非健康组织中复制)这一特征对溶瘤病毒实现免疫治疗的功能十分重要。尽管某些病毒对肿瘤表现出固有的趋向性，但一些病毒必须进行分子工程化以选择性感染肿瘤细胞。例如，衣壳可以被改变以增强病毒与在肿瘤细胞上的细胞侵入受体的结合——将来自5型腺病毒( Ad5 )的衣壳表位与来自Ad3的衣壳表位交换，促进了Ad5与肿瘤细胞的结合，因为宿主Ad3受体被黑色素瘤和卵巢癌等人类肿瘤高度表达。此外，在宿主细胞上将单纯疱疹病毒衣壳表位与靶向肿瘤特异性细胞表面受体的单链Fv片段交换能够促进选择性肿瘤感染。溶瘤病毒可能优先在抗病毒反应功能失调的肿瘤细胞中复制。而在健康组织中，干扰素和干扰素相关因子的产生限制了病毒复制，并提高了病毒清除率。进一步增强病毒在肿瘤细胞中选择性复制的策略包括删除不必要的病毒毒力基因，并插入细胞类型特异性或组织特异性启动子，这些启动子可以引导肿瘤细胞中的基因表达。在癌细胞中，致癌通路的异常激活和大量可用于病毒基因组合成的核苷酸为减毒病毒提供了复制优势。例如，E1A 基因缺失的腺病毒在含有功能失调的肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤蛋白( RB )的细胞中能更有效复制。在正常细胞中，转录因子E2F1驱动受RB与E2F1结合调控的影响。然而，在癌细胞中，由于RB的突变，E2F1与RB的结合减少，导致对E2F1的抑制减弱，促进了细胞增殖。磷酸化的PKR是细胞抗病毒反应的一部分，HSV - 1的感染细胞蛋白34.5 ( ICP34.5)能够阻断PKR信号，增加病毒的持久性并导致感染细胞凋亡减少，编码ICP 34.5的病毒基因的缺失会导致被感染的正常细胞快速凋亡。然而，在PKR信号受损的肿瘤细胞中，病毒感染不会诱导凋亡，病毒难以被清除，导致病毒复制及病毒诱导的肿瘤细胞裂解。另一个例子是溶瘤牛痘病毒的DNA合成依赖于编码胸苷激酶的非必要病毒基因——痘苗病毒中编码胸苷激酶的基因的缺失阻碍了其在通常不表达高水平胸苷激酶的正常细胞中的复制

增强肿瘤选择性病毒复制的另一种方法是将病毒基因置于组织特异性启动子的调控之下。例如，人类端粒酶逆转录酶( TERT )的启动子驱动端粒酶在肿瘤细胞中表达，将基因置于TERT启动子的控制之下能够限制它们在正常细胞中的表达。的工程化改造腺病毒表达来自TERT启动子E1A基因显示出增强的肿瘤细胞特异性病毒复制，目前正处于早期临床试验中。类似地，编码核糖核苷酸还原酶ICP 6基因缺失，且两个ICP 34.5基因都被处于E2F响应的B- MYB 启动子控制下的一个ICP 34.5基因拷贝所取代的HSV - 1在保持神经衰弱表型的同时具有强烈的胶质瘤特异性溶瘤活性。

总的来说，溶瘤病毒在肿瘤细胞中选择性复制的能力是基于病毒和肿瘤细胞的特性，以及调节病毒附着、侵入细胞和复制的其他因素。迄今为止，关于溶瘤病毒体内选择性靶向肿瘤的报道数量有限；然而，在基于HSV的溶瘤病毒talimogene laherparepvec ( T - VEC )的I期临床试验中，在26个活检样本中的19个样本中检测到残留的肿瘤细胞，其中14个样本显示肿瘤坏死。这些活组织检查样本同样证实了肿瘤细胞中HSV - 1的存在，而病毒蛋白在非肿瘤基质细胞中是检测不到的。溶瘤病毒的未来临床研究应该包括肿瘤选择性靶向和复制的确认。

诱导免疫原性细胞死亡。溶瘤病毒诱导被感染细胞的内质网 (ER) 应激反应和免疫原性细胞死亡 (ICD), 这是激活肿瘤特异免疫的有效途径。溶瘤病毒介导的 ICD 导致ATP, 尿酸和高流动性组蛋白 B1 (HMGB1)等与损伤相关的分子模式 (DAMPs)从肿瘤细胞中释放到肿瘤细胞表面。胞外 ATP在 激活DC的活化中起重要作用， HMGB1 和钙网蛋白是 DC上Toll样受体 的配体, 导致 DC的激活。钙网蛋白同样能够使肿瘤细上阻碍巨噬细胞和 DC 吞没癌细胞的CD47 受体无效。钙网蛋白还通过局部 DC和巨噬细胞增强肿瘤细胞的吞噬功能。一些报道认为, 凋亡的肿瘤细胞优先诱导免疫耐受, 而肿瘤细胞的 ICD 更有可能促进免疫反应的激活。

诱导固有免疫。被早期招募到肿瘤的CD8α + DC及CD103 + DC等未成熟DC依赖于转录因子IRF8和BATF3分化并被统称为 BATF3+ DCs。这些 DC 在病毒清除中起着举足轻重的作用, 也与抗癌免疫相关。发炎的肿瘤会产生有助于招募 BATF3+ DC的趋化因子如CCL4。事实上, 临床前的数据证实, BATF3+CD103+ DC 对于瘤内递送改良性牛痘病毒安卡拉 (MVA)的B16-F10 黑色素瘤模型内的宿主抗癌免疫是不可或缺的。病毒元素 (如 DNA, RNA 和病原体相关的分子模式 (PAMP)) 和DAMP (源于垂死肿瘤细胞) 可以结合TLR 及其他固有受体, 从而促进IL-12等细胞因子的释放 。这些早期的变化也导致了固有淋巴细胞的招募, 为根除病毒感染的细胞提供了一种早期非特异性方法。由于 MHC I类的表达在肿瘤细胞中可能减少或被许多病毒阻断, 肿瘤细胞可能更容易受到固有免疫应答的影响。

DC上MHC I类、MHC II类及共刺激分子表达的增加可以增强固有免疫, 为固有免疫与适应性免疫之间提供桥梁。此外, 通过 PRR 发现病毒元素促进了 IL-1B、IL-6、IL-12 等促炎细胞因子、肿瘤坏死因子 (TNF)及IL-8、MCP1等趋化因子的释放。然而, 尽管溶瘤病毒能诱发强有力的抗病毒反应, 大多数肿瘤存在于抑制免疫激活的微环境中。因此, 溶瘤病毒倾向于通过在肿瘤细胞内复制来改变局部免疫抑制状态, 提高固有免疫反应并促使其向适应性抗肿瘤免疫过渡。

I  型干扰素是溶瘤病毒介导抗癌活动的重要调节细胞因子。许多溶瘤病毒可以诱导 I 型干扰素或被工程化改造来表达这些细胞因子。干扰素可以增强抗原提呈, 促进适应性免疫应答的出现。但过量的干扰素产生能增加PD1、PDL1、HAVCR2、LAG3和其他调节免疫激活的检查点分子的表达，从而抑制免疫。这为溶瘤病毒和检查点阻断疗法的联合治疗提供了一个生物学理由。局部干扰素浓度也可能受到 在某些肿瘤细胞中功能失调的瘤内抗病毒机制状况的影响 , 导致 I 型干扰素的水平较低。

诱导适应性免疫。DC 将MHC II 类和 MHC I 类分子中的处理抗原分别提呈到CD4+T细胞和 CD8+ T 细胞。抗原表达导致抗原特异效应 T 细胞应答的启动和激活。被激活的 T 细胞在肿瘤引流淋巴结内进行克隆扩张, 并移动到响应CXCL9 和 CXCL10等趋化因子的肿瘤中。表达 MHC I 类分子的肿瘤细胞能够提呈肿瘤特异性抗原并被CD8+ T细胞靶向。虽然最初的T细胞反应可能是病毒特异性的，但可溶性肿瘤相关抗原和死亡肿瘤细胞的存在能够促使肿瘤抗原向T细胞交叉提呈。T细胞由此利用病毒介导的炎症环境向肿瘤靠近，带来抗原表位扩散和抗肿瘤活性。

抗原处理和提呈通路中的MHC I类表达和其他因素的下调是肿瘤免疫逃逸的重要机制。在与MHC I类分子结合之前，肽通过与抗原处理相关的转运体( TAP )从细胞质转移到ER的内腔中。HSV – 1等病毒通过靶向这一步骤来阻断抗原处理，以阻碍病毒抗原的提呈及T细胞对病毒的检测。病毒的ICP47基因产物能够抑制肽与TAP结合。出于这个原因，许多治疗性溶瘤病毒通过工程化改造删除编码ICP47的基因，以防止病毒抑制肿瘤相关抗原的处理和提呈。

除了经典的抗原提呈通路外，可溶性细胞外抗原也由MHC I类分子通过交叉提通路提呈。这对于产生针对肿瘤相关抗原的T细胞反应来说尤为重要。溶瘤病毒通过诱导免疫原性肿瘤细胞裂解并随后释放可溶性肿瘤相关抗原来增强交叉提呈。抗原表位的扩散通过交叉提呈发生。尽管溶瘤病毒的数据有限，但抗原扩散与众多免疫治疗策略的有利的治疗反应的有关。正常生理条件下的T细胞启动只需要识别抗原肽，而T细胞激活需要三个顺序传递的信号。由于病毒抗原是特别强的免疫原，它们通常能够产生所有三种T细胞激活信号，并且能够成为T细胞募集和激活的有效触发因素，这可以弥补已有肿瘤中存在的缺陷。例如，从携带肿瘤的小鼠中分离的DC具有低水平的CD80、CD86和CD40，这可以通过溶瘤病毒治疗得到逆转。在MHC I类缺陷小鼠卵巢癌细胞系中，暴露于溶瘤呼肠孤病毒促使了MHC I类的表达。总的来说，临床前数据表明溶瘤病毒克服了抗原处理和提呈方面的缺陷，并进一步促进了肿瘤携带宿主的T细胞启动和激活。这些数据也可以部分解释溶瘤病毒如何逆转T细胞抑制。

资料来源：

Bommareddy, P. K., Shettigar, M. & Kaufman, H. L. Integrating oncolytic viruses in combination cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology, 2018, vol 18, 499-513.

(常务编辑：马娃妮）

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深圳罗兹曼国际转化医学研究院

由美国芝加哥大学微生物、分子基因生物学系和芝加哥大学医学院的终身教授，美国科学院、医学院、发明家学院/中国工程院外籍院士伯纳德•罗兹曼（Bernard Roizman Sc.D.）创办，学院重在培养科研人才，在中国进行转化医学研究和生物医药的研发，并对研究成果进行产业化。

伯纳德•罗兹曼（Bernard Roizman Sc.D.）简介

伯纳德•罗兹曼是美国芝加哥大学微生物、分子基因生物学系和芝加哥大学医学院的终身教授。他毕生从事于单纯疱疹病毒的分子生物学研究，拥有“疱疹病毒之父”之称。罗兹曼终身致力于对疱疹病毒分子生物结构的全方位解读，在破译单个病毒基因功能以及部分基因对病毒潜伏感染和激活的作用，以及病毒改造治疗癌症等领域取得重要进展。

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