Redox Biol：铁死亡和线粒体这对 CP 必须磕，厦大团队国热点结合多组学，巧思多到放不下

来源： 好本子

2024 年 2 月， 厦门大学生命科学学院 张永有团队 在 Redox Biology 上发表论文 METTLI7 coordinates ferroptosis and tumorigenesis by regulating mitochondrial translation in colorectal cancer 。 研究人员利用多数据库（CTRP、DepMap 和 CCLE）、多组学、多实验方法（质谱、免疫沉淀、免疫荧光、流式等），多模型（异种移植肿瘤模型和 AOM/DSS 诱导的小鼠结肠炎相关 CRC 模型）揭示 METTL17 介导的细胞存活和线粒体铁死亡的防御机制。

图源： Redox Biology

研究背景

铁死亡是由细胞膜铁依赖性脂质过氧化作用引起的一种受调控的细胞死亡，在形态和机制上不同于自噬、凋亡和坏死。虽已确定许多影响癌细胞中铁死亡的癌症相关信号通路和基因，并且某些铁死亡诱导剂已显示出癌症治疗的潜力，但在特定癌症类型中铁死亡的精确调节仍在很大程度上未知。

最近的研究强调线粒体在铁死亡调节中的关键作用，线粒体基因表达控制可能参与铁死亡的调节，但其潜在机制仍然难以捉摸。线粒体 RNA 甲基化通过相应的修饰酶在高度保守的位点引入，其中许多修饰和甲基转移酶与人类疾病如癌症相关。

METTL17 是甲基转移酶样 (METTL) 家族的成员，与相互作用蛋白参与线粒体基因表达的调节，从而维持线粒体稳态。尽管如此，METTL17 在其他位点是否仍具有甲基转移酶活性还需要进一步研究。此外，虽然 METTL17 与雌激素受体共同激活并调节乳腺肿瘤发生相关，但其在其他癌症中的功能仍然很大程度上未知。本研究旨在探讨 METTL17 在结直肠癌 (CRC) 铁死亡调控和细胞存活测定中的生化机制和分子功能。

研究思路

本研究基于 METTL17 展开，从两方面开始研究：一方面通过对多个数据库分析发现 METTL17 促进表观遗传调节控制线粒体功能，导致线粒体 RAN 甲基化，抑制线粒体蛋白编码基因翻译进而导致铁死亡抗性增强，促进结直肠癌细胞存活。另一方面通过细胞实验、免疫荧光、质谱分析等发现 METTL17 上调 CRC 细胞增殖、迁移、侵袭促进肿瘤生长和发生。最后，综合两方面研究揭示了 METTL17 介导的细胞生存和线粒体中的铁死亡防御机制。

研究结果

1. METTL17 的表达与癌细胞对铁死亡的抗性呈正相关，并且 METTL17 的敲低使 CRC 细胞对铁死亡敏感

Cancer Therapeutics Response Portal (CTRP) 提供一个全面的数据集，包括 545 种化合物处理的 907 种癌细胞系的基因表达和耐药信息。CTRP 数据分析显示，METTL17 mRNA 表达与 GPX4 抑制剂 (包括两种经典的铁死亡诱导剂 ML162 和 RSL3) 的耐药性呈正相关 (图 1A)。

此外，对另外两个数据库 Cancer Dependency Map (DepMap) 和 Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) 的综合分析表明，METTL17 蛋白水平与不同癌细胞系的 ML162 和 RSL3 AUC 药物敏感性呈正相关 (图 1B-C)。

为确定 METTL17 是否调节 CRC 中的铁死亡，研究人员使用慢病毒介导的 shrna 敲低 METTL17 来产生稳定的细胞系。与 CTRP、DepMap 和 CCLE 数据集中观察到的相关性一致，在 SW620 和 RKO 两种表达高水平 METTL17 的结直肠癌细胞中，敲低 METTL17 增加对 ML162 或 RSL3 诱导的铁死亡的敏感性，而铁螯合剂去铁胺 (DFO) 挽救了细胞的生存能力 (图 1D-E)。

此外，PI 染色显示，ML162 或 RSL3 处理过的 METTL17 缺陷细胞表现出更多的细胞死亡，DFO 可显著逆转死亡 (图 1F-H)，表明敲低 METTL17 使 CRC 细胞对 GPX4 抑制敏感。

图 1．METTL17 的表达与癌细胞对铁死亡的抗性正相关，并且 METTL17 的敲低使 CRC 细胞对铁死亡敏感。

2. METTL17 在人结直肠癌中过表达，敲低 METTL17 在体外抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和致癌特征

癌症基因组图谱 (TCGA) 分析显示，与正常结直肠癌组织相比，结直肠癌组织中 METTL17 mRNA 表达上调 (图 2A)。相应地，METTL17 蛋白在结直肠癌组织中的表达高于邻近的正常组织 (图 2B 和 C)。随后，研究人员评估 METTL17 在结直肠癌中的功能。

首先，基于 DepMap 和 CCLE 数据库，观察到 METTL17 mRNA 表达水平在所有 CRC 细胞系中的不同分布，表明 METTL17 表达与其在 CRC 中的基因作用之间存在相关性。其次，与正常结肠上皮细胞系相比，结直肠癌细胞系中的 METTL17 蛋白水平显著升高 (图 2D)。在结直肠癌细胞系中，RKO、SW620 和 DLD1 表现出较高的 METTL17 表达。为确定 METTL17 在结直肠癌细胞进展中的作用，研究人员使用两种不同的短发夹 RNA 来抑制 METTL17 在三种人结直肠癌细胞系 SW620、RKO 和 DLD1 中的表达，并通过 Western blot 证实其敲除效率 (图 2E)。

结晶紫实验表明，在 METTL17 敲低的 CRC 细胞中，细胞增殖受到显著抑制 (图 2F)。此外，细胞迁移和侵袭实验显示，RKO、SW620 和 DLD1 细胞中 METTL17 的下调显著抑制它们跨膜迁移和通过基质包被膜侵袭的能力 (图 2 G)，表明 METTL17 的下调阻碍 CRC 细胞的迁移和侵袭。集落形成分析进一步表明，METTL17 敲低显著抑制 CRC 细胞的生长 (图 2 G)。

细胞周期分析表明，METTL17 敲低导致 G0/G1 期延长，S 期缩短，这表明在 METTL17 缺失的 CRC 细胞中，G0/G1 期细胞周期停滞增加 (图 2 H)。为阐明 METTL17 调控 CRC 细胞存活的机制，研究人员对 METTL17 敲低和野生型 CRC 细胞进行 RNA-seq 分析和基因集富集分析 (GSEA)。与 METTL17 缺陷细胞在 G0/G1 期观察到的细胞周期停滞一致，GSEA 显示，与对照细胞相比，METTL17 缺陷 CRC 细胞在细胞周期相变 (图 2I) 和 DNA 复制 (图 2J) 方面表现出缺陷。

根据 GSEA 数据，研究人员发现许多致癌特征基因组因 METTL17 缺乏而下调 (图 2K)。这些发现共同表明，敲低 METTL17 可显著抑制结直肠癌细胞的致癌活性。研究人员还发现恢复 METTL17 表达部分逆转了在 METTL17-敲除的 SW620 细胞中观察到的被抑制的细胞增殖 (图 2L)。

综上所述，这些结果表明 METTL17 在人类 CRC 中过表达，其敲低至少在一定程度上通过破坏致癌途径抑制 CRC 细胞的增殖、迁移、侵袭、集落形成和细胞周期转变。

图 2 METTL17 在结直肠癌中高表达，在体外，敲低 METTL17 可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和致癌特征。

3. METTL17 缺乏在体内抑制异种移植物肿瘤生长和 AOM/ DSS 诱导的 CRC 肿瘤发生

为评估 METTL17 在体内 CRC 肿瘤发生中的影响，研究人员建立异种移植肿瘤模型和 AOM/DSS 诱导的小鼠结肠炎相关 CRC 模型。首先，将 METTL17 敲除和对照 SW620 细胞皮下注射到裸鼠体内。结果显示，METTL17 敲低的肿瘤比对照肿瘤生长得慢得多，重量也小得多 (图 3A-C)。Western blot 和免疫染色分析表明，METTL17 敲低的肿瘤显示出 β-Catenin 的表达降低，而 PCNA 的蛋白水平和 Ki-67 阳性细胞的数量保持不变 (图 3D-F)。

这些研究结果表明， 在异种移植肿瘤模型中，敲低 METTL17 通过不依赖于增殖的途径阻碍肿瘤生长。 其次，研究人员通过 AOM/DSS 治疗诱导结肠炎相关的 CRC。研究人员发现 METTL17+/− 保护小鼠免受 AOM/DSS 诱导的 CRC 肿瘤发生，肿瘤大小和肿瘤数量减少 (图 3 G 和 H)。在 METTL17+/−CRC 样本中，PCNA 和 β-Catenin 的蛋白表达水平下调 (图 3I 和 J)。接下来，研究人员通过 Ki-67 和 β-Catenin 免疫染色评估 WT 和 METTL17+/− 小鼠结直肠肿瘤的细胞增殖率和恶性程度。

结果显示，METTL17 缺乏抑制肿瘤进展，METTL17 +/− 小鼠表现为良性腺瘤，腺管结构分化良好，β-Catenin 在细胞质中弥散分布，而 WT 小鼠表现为恶性肿瘤，肿瘤低分化，β-Catenin 在细胞核中定位 (图 3K)。这些研究结果表明， METTL17 缺乏在体内抑制异种移植物肿瘤生长和 AOM/DSS 诱导的 CRC 进展。

图 3 METTL17 缺乏可减少异种移植物肿瘤生长和 AOM/DSS 诱导的 CRC 肿瘤发生。

4. METTL17 的敲低破坏线粒体稳态，促进脂质过氧化和 ROS 的产生

为阐明 METTL17 影响铁死亡敏感性和结直肠癌发展的机制，研究人员研究 METTL17 在癌细胞中的细胞分布和功能。首先，研究人员将 RKO 细胞分离成线粒体和细胞质部分，对这两部分进行 Western blot 检测，以评估内源性 METTL17 蛋白水平和细胞定位。研究人员的研究结果表明，METTL17 在线粒体中主要表达 (图 4A)。

其次，由于现有的 METTL17 抗体均不符合研究人员的免疫荧光质量标准，研究人员生成了 c 端 flag 标记的 METTL17 构建物，该构建物在 CRC 细胞中过表达 (图 4B)。在 3xHA-EGFP 标记的 RKO 和 SW620 细胞系中过表达 METTL17-C-Flag 后，研究人员通过荧光共聚焦显微镜观察到线粒体中大量的 METTL17-C-Flag 定位 (图 4C)。这些结果证实 METTL17 的线粒体定位。

为研究 METTL17 在线粒体中的功能，研究人员检测 METTL17 敲除细胞中能量代谢的变化。测量线粒体耗氧率 (OCR)，并观察到 METTL17 敲除后 OCR 的显著抑制，其特征是基础呼吸、ATP 产生、最大呼吸和备用容量减少，特别是在 shM17#5 细胞中 (图 4D)。与此一致，GSEA 分析显示下降 METTL17 缺陷细胞中与氧化磷酸化相关的基因的调控 (图 4E)，表明 METTL17 敲低导致线粒体功能障碍。随后，研究人员评估细胞外酸化率 (ECAR)，发现 METTL17 敲低细胞的糖酵解能力下降，糖酵解储备减少 (图 4F)。

此外，研究人员发现 METTL17 的敲低显著抑制癌细胞的葡萄糖摄取能力 (图 4 G)，表明 METTL17 缺失细胞的葡萄糖供应受损。总的来说，这些发现揭示 METTL17 在维持线粒体稳态和糖酵解中的关键作用。由于 ROS 和氧化脂质的积累是铁死亡的决定因素，线粒体事件在这一受调节的细胞死亡过程中起着至关重要的作用。随后，研究人员分别通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜使用四种荧光探针评估活细胞中 ROS 和氧化脂质的细胞和线粒体水平。 ML162 处理 3 h 后，SW620 细胞表现出脂质过氧化物的增加，METTL17 缺乏显著促进铁致死亡应激下脂质过氧化物的形成。

C11-BODIPY 和 MitoPerOx 的红色荧光转变为绿色荧光 (图 4 H)，表明 METTL17 敲除的癌细胞在趋铁应激过程中细胞内和线粒体脂质过氧化过度。同时，DCFH-DA 和 MitoSOX 染色显示，ML162 治疗后，METTL17 敲除的癌细胞的细胞内和线粒体 ROS 水平显著升高 (图 4I)。通过透射电镜发现，METTL17 敲除细胞中存在明显的线粒体损伤，其特征是 ML162 攻击后线粒体收缩增加，嵴减少 (图 4J 和 K)。

接下来，研究人员通过检测关键铁死亡标志物的蛋白水平来研究 METTL17 调控的铁死亡机制。令人惊讶的是，METTL17 敲低显著抑制了 ML162 处理后血红素加氧酶 1(HMOX1/HO-1) 的表达，并显著上调 NRF2 的表达 (图 4M)。然而，在基础和 ML162 处理条件下，在 METTL17-敲除细胞中，铁死亡的关键调节因子 xCT、GPX4 和 ACSL4，保持不变 (图 4M)。

此外，研究人员发现 METTL17 敲低足以增加 NADH 水平 (图 4L)。在铁死亡应激下，METTL17 敲低加速 NADH 的下降 (图 4L)，提示在铁死亡期间 METTL17 缺陷细胞的抗氧化系统被破坏。这些结果表明， METTL17 介导的线粒体稳态对于维持 CRC 生长和防御铁死亡至关重要。

图 4 METTL17 缺失导致铁死亡的线粒体功能障碍，并促进线粒体脂质过氧化。

5. METTL17 以线粒体 RNA 甲基化的方式控制 CRC 的线粒体翻译

METTL17 被认为是 mESCs 中线粒体基因表达的调节因子。然而，癌细胞中线粒体基因表达是否需要 METTL17 尚不清楚。首先，研究人员对来自 DepMap 数据库的 METTL17 前 100 个共依赖基因进行了全面分析，该数据库通过全基因组汇集 CRISPR-Cas9 敲除筛选对 700 多个癌细胞系的基因依赖性进行评分，并将这些基因进行基因本体 (GO) 分析。氧化石墨烯分析显示，位于线粒体内膜和线粒体核糖体的 METTL17 共依赖基因编码蛋白显著富集。

这些蛋白在协调线粒体基因表达和翻译中发挥着不可或缺的作用，影响着多种过程，如线粒体生物发生、NADH、泛醌和醌活性 (图 5A)。为验证 METTL17 参与线粒体基因调控，研究人员使用 Western blot 方法直接检测 13 个线粒体蛋白编码基因的蛋白水平。结果表明，CRC 细胞中 METTL17 的敲低导致 CRC 细胞中线粒体蛋白的整体减少 (图 5B-C)。这表明 METTL17 对于维持癌细胞中正常的线粒体基因表达是必要的。

虽然先前的研究表明，METTL17 与 12S mt-rRNA 结合，并介导 mESCs 中的 m4C840 和 m5C842 甲基化，但其可能参与其他甲基转移酶活性，特别是 mt-tRNA 和 mt-mRNA 的活性，仍然难以捉摸。为解决这一空白，研究人员对线粒体 RNA 进行了 LC-MS/MS 分析，以探索 METTL17 敲除 CRC 细胞中甲基化模式的变化 (图 5D)。研究人员的研究结果显示，与对照细胞相比，shM17#5 中的 m4C 水平显著降低至约 20%，而与 METTL17 相关的另一种 RNA 修饰 m5C 在 METTL17 敲除细胞中降低至约 75%(图 5E)。

有趣的是，m3C，一种先前与 mt-tRNA 中 METTL8 相关的修饰，在 METTL17 敲除的细胞中显示出约 70% 的减少 (图 5E)，这表明 METTL17 作为 mt-tRNA 中 m3C 的甲基化调节剂的潜在作用尚未被识别。此外，m7 G 和 m6A 的水平也随着 METTL17 的敲低而降低 (图 5E)，这表明 METTL17 可能是线粒体 RNA 甲基化的多功能调节剂。总的来说， 研究人员的结果表明 METTL17 控制着线粒体通过调节 CRC 细胞中 12S mt-rRNA 中 m4C 和 m5C 的甲基化，mt-tRNA 中 m3C 和 m7 G 的甲基化，以及 mt-mRNA 中 m6A 的甲基化来影响基因表达。