iMeta | 苏州大学张勇组发现阿克曼氏菌改善一型糖尿病

阿克曼氏菌通过促进小鼠肠道分泌IGF2改善链脲佐菌素诱导的高血糖和肌肉萎缩

●  注射链脲佐菌素（STZ）5个月后存活小鼠的血糖水平降低，肠道微生物中Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）菌比例增加；

●  灌胃灭活的A. muciniphila菌增加了小鼠肠道微生物群落的多样性，并增强了肠道的免疫和代谢信号通路；

●  A. muciniphila菌促进了T1D小鼠肠道中IGF2 蛋白的分泌，从而激活了骨骼肌中的 IGF2 信号传导，增强了T1D小鼠肌肉和整体代谢。

引  言

1 型糖尿病（T1DM）的特点是胰腺 β 细胞遭到破坏，约占所有糖尿病病例的 10%-15%，最常见于儿童糖尿病。T1DM 的发病机制与 T1DM 相关自身抗体的形成有关，这种抗体源于 T 细胞和 B 细胞之间的同源相互作用。T1DM 的并发症源于长期的高血糖，因此 目前对T1DM 的治疗主要集中在对胰岛素的相关治疗以控制血糖。作为对胰岛素治疗的补充，改变饮食习惯和定期锻炼等生活方式对于成功治疗 T1DM 也至关重要。尽管采取了这些干预措施，但仍有大量 T1DM 患者出现糖尿病并发症，强调了研究开发新治疗方法的迫切性。大规模流行病学研究探究了肠道微生物在 T1DM 发病机制中的变化和潜在作用。缺乏 MyD88 的非肥胖糖尿病（NOD）小鼠远端胃肠道的肠道微生物群落发生了改变，而通过无菌饲养无病原体的微生物群落可保护小鼠免于患上糖尿病。在患有临床前 T1DM 的儿童中，肠道微生物群落表现出拟杆菌门/厚壁菌门比例升高和多样性降低。然而，微生物群落的变化是 T1DM 的结果还是原因仍不确定，需要进一步探究。

Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）菌是一种粘蛋白降解革兰氏阴性菌，约占人类肠道微生物群落生物量的 3-5%。最近的研究强调了A. muciniphila菌对宿主代谢和免疫的积极影响。A. muciniphila菌的丰度与各种代谢紊乱有关，尤其是肥胖和 2 型糖尿病（T2DM）。补充活的或热灭活的A. muciniphila菌可改善代谢性内毒素血症，改善肠道屏障功能，进而逆转系统性代谢缺陷。然而，人们对 A. muciniphila菌与T1DM 的潜在关系仍不甚了解，也存在争议。在本研究中，我们观察到STZ诱导的 T1DM 5 个月后存活的小鼠体内，A. muciniphila菌的丰度显著增加，同时高血糖症状也得到改善。因此，我们采用灌胃法研究了A. muciniphila菌在 T1DM 进展过程中的生理作用和分子机制。我们的研究结果表明，A. muciniphila菌通过增加肠道IGF2的分泌对T1DM小鼠有益。

结  果

注射 STZ 5个月后存活的小鼠，A. muciniphila菌丰度增加

我们给小鼠注射单剂量 100 mg/Kg的 STZ，并将其饲养至 5 mpi（months post injection）。注射 STZ 后，小鼠的空腹血糖水平持续上升，在注射后 4 mpi 达到峰值（图 1A），而在注射后 5 mpi 与注射后 4 mpi 相比则明显下降（图 1A）。细菌群落β多样性分析结果显示，STZ 注射组与对照组明显分离（图 1B），4 mpi 与其他各组分离（图 1B）。Shannon指数显示，细菌群落多样性在 2.5 mpi 和 4 mpi 显著下降，在 5 mpi 部分恢复（图 1C）。细菌群落结构以及拟杆菌门和厚壁菌门的相对比例在 4 mpi 时发生了显著变化（图 1D-F，表 S1）。作为肠道健康指标的拟杆菌门/厚壁菌门比例在 4 mpi 时也显著下降（图 1G）。在 5 mpi 时，拟杆菌门和厚壁菌门的相对比例以及拟杆菌门/厚壁菌门的比例均有所恢复（图 1D-G）。而在 5 mpi 时，发现参与胰岛素信号通路的细菌群落显著富集（图 1H）。

接下来，我们进行宏基因组测序以确定关键细菌物种。结果显示，在 4 mpi 和 5 mpi 之间，A. muciniphila菌是变化最大的细菌种类（图 1I, J）。由于 A. muciniphila菌是短链脂肪酸（SCFAs）的重要生产细菌，我们研究了与SCFAs 代谢相关的一些基因的表达水平。在5 mpi 时，Acss1、Ffar2 和 Ffar3 的 mRNA 水平明显上调（图 1K 和 S1D）。这些数据表明，注射STZ诱导的T1D小鼠体内葡萄糖水平升高，细菌群落被破坏，但存活 5 mpi 的小鼠体内的A. muciniphila菌数量增加，SCFAs 代谢增强。

图1. 长期注射链脲佐菌素后存活的小鼠血糖水平下降，肠道微生物群落发生变化，A. muciniphila 菌丰度增加

(A) 注射链脲佐菌素（STZ）1 周、2 周、1 个月、2 个月、3 个月、4 个月和 5 个月前后小鼠的空腹血糖水平。(B) 注射 STZ 1 个月、2 个半月、4 个月和 5 个月后小鼠肠道微生物的PCA 分析，n = 6。(C) 小鼠肠道微生物群落的多样性指数，n = 6。(D)在门水平上的细菌群落结构分析，n = 6。(E-G) 注射 STZ 后 1 个月、2.5 个月、4 个月和 5 个月，拟杆菌门 (E) 和厚壁菌门 (F) 的相对丰度，以及拟杆菌门/厚壁菌门的比例。(H) 注射 STZ 后 4 个月和 5 个月，细菌群落的 KEGG 通路分析。(I) 种分类水平上细菌群落结构分析，n = 6。红色箭头表示A. muciniphila。(J) 注射 STZ 后不同时间段A. muciniphila的相对丰度，n = 6。(K) 注射 STZ 后 2.5 个月 4 个月和 5 个月 qRT-PCR 检测 Acss1基因的表达。数据为平均值 ± SEM。(t检验：* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001）。

灌胃 A. muciniphila 通过促进肠道 IGF2 的分泌，保护小鼠免受 STZ 诱导的肌肉萎缩的影响

野生型 C57BL/6J 小鼠在注射 STZ 前一个月分别灌胃生理盐水、热灭活的A. muciniphila（AKK）菌、醋酸钠（Ace）和丙酸钠（Pro）溶液（图 2A）。未同时注射 STZ 的小鼠设为对照组（Ctrl）。随后，注射STZ成功建模的小鼠继续进行灌胃（图 2A）。注射 STZ 后 3 周和 5 周，生理盐水组、Ace 组和 Pro 组小鼠的体重与 Ctrl 组相比明显下降，而 AKK 组小鼠的体重则没有差异（图 2B, S2A）。与生理盐水组相比，AKK 组和 Ace 组小鼠的空腹血糖水平明显降低（图 2C）。在葡萄糖耐量试验（GTT）中，AKK 组小鼠的血糖水平降低，葡萄糖敏感性提高（图 2D、E、S2B）。代谢分析表明，灌胃 A. muciniphila 能显著提高小鼠的氧气消耗量、二氧化碳产生量和产热量（图 2F-H，S3A-E）。而呼吸交换率没有差异（图 S3F）。灌胃 A. muciniphila 还能减少 STZ 诱导的 T1D 小鼠的水摄入量，从而改善糖尿病综合征（图 2I）。小鼠的食物摄入量和活动量没有变化（图 S3G-I）。体脂扫描仪扫描结果显示，灌胃A. muciniphila菌的小鼠瘦体重略有增加（图S4A）。事实上，与生理盐水组相比，AKK 组小鼠不同肌肉组织（包括胫骨前肌（TA）和股四头肌（Qu）的重量都有所增加（图 2J 和 K）。TA的横截面也显示，AKK组的平均纤维尺寸（图2L）和较大尺寸纤维的比例显著增加（图S4B、C）。与生理盐水组相比，AKK组小鼠TA的MSTN蛋白水平以及Atrogin-1、Trim63和Mstn的mRNA水平均显著降低（图2M、N、S4D、E）。此外，AKK组与生理盐水组不同脂肪层的重量没有变化（图S4F、G）。

通过转录组测序，我们在对照组与生理盐水组和 AKK 组与生理盐水组之间分别发现了 1075 和 806 个差异表达基因（DEGs）（图 2O、S5A、表 S3）。KEGG显示，线粒体和胰岛素受体结合相关基因特别富集于AKK组（图S5B）。在灌胃A. muciniphila后，发现 Cpt2、Ppargc1α、Cox7a1、Acss2、Hk2、Ldhb、Slc2a1、Irs2、Insig1、Fndc5（Irisin，一种肌肉分泌的肌动素，可促进全身代谢）和 Myh2（肌球蛋白重链 2，肌肉的关键结构蛋白）的表达水平被上调（图 2P）。此外，ATGL 和 CPT2 的蛋白水平在 AKK 组 TA肌肉中显著增加（图 2Q，R）。因为多项研究都强调了灌胃A. muciniphila对肠道的影响，因此接下来探究了肠道微生物群落和肠道转录组的变化。16s rRNA测序表明，灌胃A. muciniphila后肠道微生物群落的多样性明显增加（图 S6，表 S4）。转录组分析表明，灌胃A. muciniphila后，先天性免疫反应、脂质转运、葡萄糖代谢过程、质膜和碳水化合物结合等相关基因上调（图 S7A-C，表 S5）。Western-blot 分析显示，AKK 组肠道中 ATGL、CPT2 和 MTCO1（代表线粒体复合物 4）的蛋白水平均显著升高（图 S7C，D）。

为了确定导致灌胃A. muciniphila诱导肌肉增生的关键分泌蛋白，我们分别从生理盐水与对照组和 AKK 与生理盐水组中筛选了相同阈值下的 DEGs（图 2S，表 S6）。通路富集表明，242 个重叠的 DEGs 主要涉及免疫系统过程、内质体和内质网（图 2T，S8A）。尤其是Igf2（胰岛素样生长因子2），它编码一种细胞因子IGF2，对骨骼肌的生长和代谢至关重要。我们验证了肠道中 Igf2 的 mRNA 和蛋白水平以及血清中 IGF2 的水平在 A. muciniphila 处理后都有所提高（图 2V，W）。但肌肉中的 IGF2 蛋白水平没有变化（图 S8B）。然而，作为 IGF2 信号通路关键因子的 Igf2r 和 Igf2bp1 的 mRNA 水平在 AKK 组 TA 肌肉中显著增加（图 2X）。这些结果表明，灌胃A. muciniphila可通过促进肠道分泌IGF2来抑制STZ诱导的肌肉萎缩并增强骨骼肌的新陈代谢。

图2. 通过促进肠道 IGF2 的分泌，灌胃 A. muciniphila 可保护小鼠免受 STZ 引起的肌肉萎缩

（A）野生型 C57BL/6J 小鼠灌胃和注射 STZ 的示意图。(B）STZ 诱导 T1D 5 周后，灌胃生理盐水、A. muciniphila (AKK)、醋酸钠（Ace）和丙酸钠（Pro）的小鼠体重。(C）注射 STZ 5 周后小鼠的空腹血糖水平。(D) 注射 STZ 后小鼠进行葡萄糖耐量试验（GTT）时的血糖水平。(E）根据 GTT 计算的曲线下面积（AUC）。（F-H）AKK 组和生理盐水组小鼠的氧气消耗量（F）、昼夜平均氧气消耗量（G）以及氧气消耗量与体重的相关性（H）。(I) STZ 注射后 AKK 组和生理盐水组小鼠的耗水量。(J, K) STZ 诱导 T1D 后，从灌胃生理盐水、AKK、Ace 和 Pro 的小鼠身上分离出的股四头肌（Qu）和胫骨前肌（TA）图像（J）和重量（K）。(L）生理盐水组和 AKK 组肌肉横截面的H&E 染色图像。(M) TA 中 MSTN 蛋白表达水平。(N) STZ 注射后生理盐水组和 AKK 组 TA 肌肉中 Mstn 的mRNA 水平。(O）火山图显示了用 AKK 组和生理盐水组 TA 肌肉的 RNA 测序得出的所有基因的 Log₂Fold Change和 -Log₁₀ P-value值，红点代表 > 1.3 的显著差异基因表达（DEGs），绿点代表无变化的基因。(P）注射 STZ 后，AKK 组和生理盐水组参与脂质和葡萄糖代谢的关键 DEGs 热图。（Q, R）TA 肌肉中 CPT2 和 ATGL 蛋白表达水平。（S）Ctrl组 VS 生理盐水组和生理盐水组 VS AKK 组重叠 DEGs 的维恩图。(T）所有重叠 DEGs 的 GO 富集图，表明葡萄糖代谢过程中的特异性变化。（U）Ctrl组、生理盐水组和 AKK 组 Igf2 的基因表达水平。（V）注射 STZ 后，生理盐水组和 AKK 组肠道 中Igf2的mRNA水平检测以及血清中IGF2 蛋白的浓度。(W）注射 STZ 后 AKK 组和 生理盐水组肠道 IGF2 的蛋白表达量。(X）注射 STZ 后，生理盐水组和 AKK 组 TA 肌肉中 Igf2r 和 Igf2bp1 的mRNA 水平。数据代表平均值 ± SEM（t 检验、双向方差分析和方差分析：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

讨  论

肠道微生物群落在宿主免疫和新陈代谢中发挥着至关重要的作用，但有关肠道微生物群落与 T1DM 关系的研究仍处于起步阶段。我们发现，自发的微生物群落恢复可能是长期存活的 T1DM 小鼠血糖改善的驱动因素。对芬兰 T1DM 患儿进行的宏基因组学分析也显示，丁酸盐产生菌与A. muciniphila菌的比例显著降低。在 NOD 小鼠中，A. muciniphila 的丰度与患 T1DM 的风险成反比。A. muciniphila菌通过激活 FFAR2 促进 SCFA 的产生，从而在肠道中发挥抗炎作用。在本研究中我们发现，随着注射 STZ 5 个月后存活的小鼠高血糖状况的改善，A. muciniphila的比例和 Ffar2 的表达均显著增加。因此，我们不能排除抑制高血糖的作用来自A. muciniphila或A. muciniphila产生的 SCFAs的可能性。为了分析这些可能性，我们分别向小鼠灌胃了热灭活的A. muciniphila以及乙酸盐和丙酸盐。结果表明，热灭活的A. muciniphila（而非其 SCFAs）能充分调节肠道炎症和代谢通路。

目前A. muciniphila菌在防治各种疾病方面的分子机制已得到广泛研究。热灭活的A. muciniphila菌可以显著改善二型糖尿病小鼠的症状，这表明了A. muciniphila可以直接与肠道屏障之间发生相互作用。本研究也发现热灭活后的A. muciniphila能通过肠道-IGF2-肌肉轴改善 STZ 诱导的小鼠一型糖尿病。IGF2 及其结合蛋白 IGF2BP1 是肌肉分化、生长和功能的关键调节因子。因此，我们推测A. muciniphila能以直接结合依赖的方式促进小鼠肠道分泌 IGF2。肠上皮细胞也能分泌 IGF2。不过，要证实目前的机制，还需要进行拯救或中和试验。此外，在乙酸灌胃小鼠体内观察到血糖水平明显降低，而乙酸是 A. muciniphila 最重要的代谢产物之一。因此，它无法绕过 A. muciniphila 的代谢和分泌作用。综合来看，A. muciniphila的代谢益处应该是通过直接和间接相互作用改善肠道微生物群落和肠道屏障功能的综合结果。

另一个有趣的观察结果是，灌胃 A. muciniphila 能特异性地抑制 STZ 诱导的肌肉萎缩，而不影响脂肪组织。T1DM 患者骨骼肌异常，包括蛋白质合成和降解改变、糖酵解受损、线粒体功能障碍和超微结构改变。灌胃 A. muciniphila 不仅增加了肌肉质量和横截面积，还增加了与代谢相关的信号通路。这些观察结果与肥胖症和 T2DM 的研究结果大相径庭，在肥胖症和 T2DM 研究中，A. muciniphila有抑制肥胖和促进代谢的作用，却没有改变肌肉质量和功能。由于 T1DM 不同于肥胖症和 T2DM，特别是考虑到高胰岛素血症，因此A. muciniphila的抗萎缩能力可能依赖于肌肉中胰岛素信号的恢复，Igf2r 和 Igf2bp1 表达水平的提高就是证明。

结  论

综上所述，本研究揭示了灌胃A. muciniphila可通过促进肠道分泌IGF2蛋白，作用于肌肉从而保护小鼠免受STZ诱导的高血糖和肌肉萎缩的影响。注射 STZ 5 个月后存活的小鼠血糖水平明显降低，肠道微生物群落结构恢复，肠道菌群中A. muciniphila比例显著增加。给T1D小鼠灌胃热灭活的A. muciniphila增加了肠道微生物群落的多样性，并增强了肠道中的免疫和代谢信号通路。从机制上讲，A. muciniphila促进了肠道中IGF2 的分泌，随后激活了骨骼肌中的 IGF2 信号传导。我们的研究结果表明，灌胃热灭活的A. muciniphila菌可能是治疗 T1DM 及其相关高血糖症的一种潜在策略。

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“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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