摘要：在设计冷冻干燥工艺之前，对制剂进行全面表征并了解冷却和升温过程中发生的热事件和物理状态变化是非常关键的。描述并举例说明了各种冷冻干燥特性的定义。介绍了如MDSC和FDM等可用于在不同条件下表征并确定制剂的冷冻干燥特性/值的各种技术，以及实验设计背后的科学原理、数据分析和解释方法，并通过案例研究进行了说明。最后，讨论了如何使用Gordon&Taylor方程理论预测某些冷冻干燥特性，并举例说明。
1.引言
市场上常见的冷冻干燥产品，其冷冻干燥过程需要几天到几周时间，但生产出的产品缺乏药品的优雅性，难以复溶，复溶时间长，批间和瓶间质量属性存在变异性/不均匀性；最重要的是未能实现常温储存稳定性，需要冷链运输和储存。这些问题源于对辅料的热行为和冷冻干燥特性缺乏清晰的了解，以及在设计制剂和工艺时对辅料的选择及其重量比的考虑。此外，在设计制剂和工艺时，还应考虑商业生产要求工艺应尽可能短（即经济可行），在设备能力范围内操作，并具有适当的安全余地和高效的工厂利用率。因此，上述期望要求制剂和冷冻干燥循环的设计应使塌陷温度最大化，干燥速率尽可能高，并且足够稳健，能够在典型的生产冷冻干燥机上实施。由于冷冻干燥是一个低温过程，是一个耗时的过程，准确确定制剂的冷冻干燥特性，如共晶熔点温度(Te)、最大冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度(Tg’)、结晶和退火温度及时间、Tg’温度下的残留未冻结水含量(Wg’)以及干燥粉末的玻璃化转变温度(Tg)，不仅是第一步，也是冷冻干燥工艺设计的核心。结晶的开始和退火温度指导冷冻参数和协议，而Tg’和/或Te值则指导初干条件（搁板温度、腔室压力和时间）的选择。Wg’值也为次干条件的选择、从初干到次干的升温速率、次干的温度和时间奠定了基础。冷冻干燥饼的Tg值指导加速稳定性研究条件的选择，并为产品的推荐运输和储存条件奠定了基础。给定制剂的上述冷冻干燥特性的总体值在很大程度上取决于制剂中存在的各个辅料/成分的这些特性值及其在混合物中的重量比。生物制药制剂通常会在努力稳定易变的生物制品的同时，满足最终用户要求，而形成多组分盐系统。因此，对这些成分的热行为进行表征，无论是单独还是混合物中，并在选择辅料/制剂的组成和工艺条件之前确定这些特性的值，变得至关重要。大多数用于生物制药制剂的辅料包括缓冲剂、表面活性剂、稳定剂、填充剂和渗透压调节剂，它们由于浓度、温度（冷却和升温）以及存在或不存在其他辅料的变化而表现出不同的行为。制剂和工艺开发是相互依赖的，制剂候选筛选应考虑原型的冷冻干燥特性以及稳定性方面。有两种技术：冷冻干燥显微镜(FDM)和调制差示扫描量热法(MDSC)，它们通常用于了解辅料在冷冻状态下的单独和混合物的热行为/热事件以及物理状态，并确定上述冷冻干燥特性，见表1和表2。塌陷温度数据通过冷冻干燥显微镜获得，Tg’数据通过DSC以大约10°C/min的升温速率获得，代表玻璃化转变区域的中点。括号中的值是通过从非结晶混合物外推到纯化合物估计的。
2.冷冻干燥特性的定义
2.1.塌陷温度
在一个所有辅料在冷冻后形成单一非晶态系统的体系中，在初干过程中不失去与冷冻固体尺寸相当的多孔“蛋糕状”结构的最大允许产品温度，称为塌陷温度。如图1所示，根据产品温度与塌陷温度的偏离程度，存在不同程度的塌陷，即塌陷开始、部分塌陷和完全塌陷。在高于塌陷温度的条件下干燥产品会导致材料变软并发生粘性流动，从而使多孔结构塌陷。在初干阶段未完全升华冰的情况下进入次干阶段会导致剩余冰融化，导致回熔。图1b说明了不同程度的回熔。塌陷温度可以通过冷冻干燥显微镜直接显微观察冷冻干燥过程中塌陷/结构丧失来测量。Pikal等人研究了实验室程序确定的塌陷温度与生产过程中观察到的塌陷之间的差异。他们观察到，随着升华速率的增加（即溶质浓度的降低），塌陷温度增加，在恒定的升华速率下，随着固体表面积的增加，塌陷温度可能增加。他们还注意到，通常情况下，产品在小瓶中的冷冻干燥会在比显微方法测量的塌陷温度稍高的温度下塌陷。
图 1 (a) 各种不同程度的塌陷：(A) 微观或塌陷开始，(B) 部分塌陷，(C) 完全塌陷。(b) 各种不同程度的回熔。
Tg’是最大冷冻浓缩溶质的玻璃化转变温度(Tg’)，塌陷温度和玻璃化转变温度Tg’并不相同。当使用DSC或MDSC测量时，塌陷温度将比Tg’值高2–3°C，因为在低升温速率下测量时，系统不会发生粘性流动，直到产品温度超过Tg’值2–3°C时，才会观察到结构丧失。
2.2.共晶熔点温度(Te)
共晶混合物是由两种或更多结晶化合物组成的物理混合物，它们在与单一化合物相同的温度下一起熔化，该温度被称为共晶温度。如图2所示，根据溶液的组成和产品温度与共晶熔点温度的偏离程度，存在不同程度的熔化。在一个所有辅料在冷冻时结晶的体系中，Te将是塌陷温度/临界温度。在一个同时存在非晶态和结晶体系的二元体系中，如果结晶成分是主要成分，则在产品温度高于Tg’但低于Te的情况下进行初干，将使非晶态成分在结晶相表面塌陷，而结晶相将为饼结构提供必要的机械支撑。另一方面，如果非晶态成分是主要成分，结晶相是次要成分，则在这些情况下，高于Tg’但低于Te的干燥将是危险的，并且取决于产品温度与Tg’的偏离程度，因为结晶结构无法提供所需的机械支撑。
图 2 各种不同程度的共晶熔体示例：(a) 完全共晶熔体，(b) 部分共晶熔体，(c) 优雅的晶体蛋糕
3.表征技术
通常用于确定冷冻干燥特性的表征技术有(1)冷冻干燥显微镜，(2)调制差示扫描量热法(MDSC)，和(3)电阻。
3.1.差示扫描量热法(DSC)
该技术已经存在多年，由于热事件涉及热流，该技术已成功用于定量测量由一级不可逆/动力学热事件（如结晶和共晶熔化（放热或吸热））和二级可逆事件（如玻璃化转变）引起的热流和热容变化作为时间和温度的函数。原理 标准或常规DSC的基本原理基于欧姆定律，该定律控制热流，公式1
其中dQ/dt 是热流，ΔT 是参考和样品之间的温度差，RD 是常数的热阻。样品放在铝制样品盘中，空盘作为参考，它们被放置在由康铜制成的圆盘上，热通过圆盘从样品和参考传递到放置在圆盘下方的由铬镍合金制成的热电偶。这些热电偶测量差示热流。
虽然在标准DSC中，腔室通过加热块中的孔通入氮气或氩气，以确保均匀稳定的热环境，从而得到控制的平坦基线，但有时由于圆盘上的一些杂质，可能会观察到弯曲的基线，这使得一些真正的转变变得可疑。为了确认这些转变是否真实，常常需要重复实验。为了克服这些困难并解决一些复杂的转变，Mike Reading提出了调制差示扫描量热法(MDSC)的想法，即在传统的线性加热或冷却斜率上施加正弦波调制，因此MDSC的指导原则是同时应用两种升温速率，并测量它们如何影响热流速率。因此，样品经历了两种升温速率或冷却曲线，就像同时进行两个实验，一个常规线性（平均）升温速率（图3中的虚线）和另一个正弦波（瞬时）升温速率（图3中的点划线）。
图 3 MDSC 中的加热速率曲线。
平均升温速率提供总热流信息，而正弦波升温速率从响应温度变化速率的热流中提供热容信息。这样做的优点是，它将能够从总热流中分离出可逆和不可逆热流，如以下公式2所示。
标准或常规的DSC仅测量总热流（dQ/dt），而MDSC测量总热流（dQ/dt）、可逆热流（与样品的比热容和温度变化速率有关）以及不可逆热流（与绝对温度和时间有关）。可逆热流和比热容与玻璃转变有关，而玻璃转变本质上是可逆的，而结晶、熔化和热焓则与不可逆热流和动力学性质有关，见图4。
MDSC相对于标准DSC的优势：1.能够解析复杂的转变，例如从玻璃转变温度的松弛焓，这些转变同时出现，可能会使玻璃转变看起来像是熔化转变。同样，辅料在熔化之前或期间的结晶使得确定样品的真实结晶度变得困难。2.能够检测到通常被标准DSC基线漂移所掩盖的弱转变。3.标准DSC的一个缺点是某些测量，如比热容和热导率，需要进行多次实验。4.常规DSC结果总是灵敏度和分辨率之间的折中。分辨率或分离仅几度之差的转变需要使用小样品和低升温速率，但热流信号的大小会随着样品尺寸和升温速率的降低而减小。这表明任何分辨率的提高都会伴随着灵敏度的降低，反之亦然。可以通过(1)增加样品尺寸，从而增强转变的幅度；(2)增加扫描速率；以及(3)增加浓度但保持混合物中各组分的质量比恒定来提高弱转变的灵敏度。这些增加样品尺寸和扫描速率的缺点是它们会使转变向更高温度移动，也可能导致附近的热事件合并。玻璃转变对升温速率的依赖性需要进行校正，因为在冷冻干燥中使用的升温速率要低得多，实际值会低几度，特别是在干燥在接近Tg'的产品温度下进行的情况下。使用功率-时间曲线的导数可以获得Tg'的更高分辨率和灵敏度。
3.1.1.方法设计考虑
如上所述，在MDSC中与标准DSC不同，样品同时受到两个升温速率的影响，以获得与热事件相关的所有信息，优化这些升温速率的值是获得高质量数据的关键。在选择和优化这些值之前，应考虑三个关键参数：平均升温速率、温度调制周期和幅度。1.保持平均升温速率（°C/min）足够慢，以便在感兴趣的转变中获得足够数量的调制周期。2.应选择调制周期，以便有足够的时间让热量在传感器和样品之间流动。3.调制幅度（±°C）既影响灵敏度也影响分辨率。保持幅度较大以获得更高的灵敏度，但不要太大以至于降低分辨率。
调制温度周期的选择
调制温度周期是完成一个调制周期所需的时间，以秒为单位。周期的选择在10到200秒之间变化，取决于样品的重量、厚度、导热性以及样品皿和实验目的。以下是可以作为起点并根据需要进一步优化的建议或指南。在选择周期时需要考虑的一个关键点是，它不应比定量热流所需的更长，否则将需要降低平均升温速率。
•对于含有15 mg的压花铝皿中的样品，建议使用45秒的周期，对于含有最多15 mg的密封铝皿中的样品，建议使用60秒的周期。
•对于材料的比热容测量，建议使用100秒。
•对于不锈钢密封皿中的大体积样品，建议使用200秒的周期。
调制温度幅度的选择
与标准DSC类似，MDSC也通过增加调制温度幅度来提供对涉及比热容变化的转变的更高灵敏度，因为加热速率的变化更大。仪器允许选择从±0.001°C到10°C的幅度值；然而，通常发现幅度大于±2.0°C会降低分辨率，幅度小于±0.1°C不建议使用，因为它们灵敏度较差。幅度可以选择以提供冷却或不提供冷却。对于确定玻璃转变（Tg）温度，这些温度是比热容变化的函数，发现同时在温度调制期间加热和冷却都是最佳的。例如，在图5中，平均升温速率为1.0°C/min，调制周期为60秒，调制幅度为±0.319°C，这种条件使调制温度随着平均温度的升高而增加和减少。这个信号的时间导数表明平均升温速率为1.0°C/min，而调制升温速率从大约-1.0到3.0°C/min不等。这个总体范围4.0°C/min是所选周期和幅度的结果。在温度调制期间同时提供加热和冷却的条件被发现最适合测量玻璃转变温度。
图 5 调制温度随着平均温度的升高而升高和降低。该信号的时间导数显示，平均加热速率为 1.0°C/min，而调制加热速率大约在 -1.0 到 3.0°C/min 之间
为了确定结晶温度，“热-等温”条件将是理想的，其中加热速率被设计为趋于零（等温），且无冷却。这在图6中得到了很好的说明，其中调制周期（60秒）和调制幅度（±0.319°C）与图5所示相同，但平均加热速率已增加到2°C/min。可以注意到，这些条件仍然提供了一个4°C/min的范围（0–4°C/min），但现在在调制期间没有冷却。基于经验，TA仪器公司制定了一个表格，表3，以方便选择调制温度幅度，以下是指导方针：
1.首先选择将用于实验的调制周期和平均加热速率。
2.为了在给定的周期和加热速率下进行“热-等温”条件的实验，可以直接从表3中获取相应的幅度值。
3.对于“热-冷”条件，任何大于表中所示的幅度值都将在调制期间产生冷却。幅度值应按照以下建议作为起始条件进行增加，并可以根据感兴趣的热事件进一步优化。
在标准Tg测定中，样品大小在10–15mg范围内，使用3°C/min的加热速率，40秒的周期，并使用表3中所示值的2倍幅度。
在Tg值难以确定的情况下，如图6所示，样品重量在10–20mg范围内，使用2°C/min的加热速率，60秒的周期，以及表3中所示值的4倍幅度。
图 6 选择与图 3 中相同的调制周期(60s)和相同的调制幅度(±0.319°C)的条件的结果。不同之处在于平均加热速率已增加到 2°C/min
在Tg与大的焓松弛相关的情况下，使用5–10mg范围内的样品大小，更慢的1°C/min加热速率，40秒的周期，以及表3中所示值的1.5倍幅度。
一般来说，对于大多数实验，建议起始重量为10mg，并且可以根据需要增加以提高灵敏度或减少以提高分辨率。
平均加热速率的选择
应该使得至少有3–4个调制周期适合于转变的温度范围内，无论是玻璃转变还是其他涉及热容阶跃变化的热事件，以便能够有信心且无歧义地确定所考虑的转变/热事件。调制周期的数量应在阶跃的外推起始点和外推终点之间确定，并应为3–4个周期。
对于涉及峰的转变，最小值在峰的半高处确定，如图7所示。在接近250°C的温度处，在250°C附近熔融峰的半高处，大约有6–7个周期，这满足了四个（4）个或更多的要求。然而，在接近150°C的冷结晶峰的半高处只有3个周期，表明平均加热速率略快。需要注意的是，该实验是在4°C/min下进行的，如果以3°C/min进行，将获得更好的结果，因为所有涉及峰的转变在峰的半高处都将有四个或更多的周期，并满足要求。
图 7 过渡中调制周期数量对加热速率的依赖性演示
3.2.冻干显微镜（FDM）
冻干显微镜是另一种技术，可以在偏振光显微镜下直接观察配方成分在冻结和冻干过程中的物理行为。它可以确定冻干属性，如塌陷温度、结晶温度、最佳退火温度和时间以及共熔温度。它涉及将样品放置在盖玻片和冷台室之间，该冷台室放置在显微镜下，整个装置就像一个微型冻干器。然后将样品冷冻到预选的温度和冷却速率，之后在室中抽真空以开始干燥过程。在显微镜下观察干燥前沿后面的结构，以查看其是否在保持结构的情况下干燥。如果它在保持结构的情况下干燥，则温度缓慢增加，直到结构开始破裂。结构破裂的严重程度以起始、部分或完全塌陷来定义。然后可以操纵冷台的温度，以确定产品将塌陷或熔化的温度。
3.2.1.设备和实验程序
它由三个主要部分组成：(1) 温度控制的冻干台（冷台），(2) 通过光学窗口可以通过显微镜观察样品中冻结或/和干燥的进展，以及 (3) 可编程的温度控制器。程序将样品架插入冷台上，并调整XY操纵器，使样品架位于银块的中间。将石英坩埚放置在样品架内，并在冷台和坩埚之间放置一小滴硅油以实现完美的热密封。将大约3–5μL的样品加载到石英坩埚的中心，并通过真空镊子用9mm玻璃盖玻片覆盖。使用XY操纵器移动样品架，使样品的边缘位于冷台的孔径孔上，这有助于在分析开始后定位样品边界。调整显微镜，并首先用10×物镜然后用20×物镜聚焦样品边缘。打开软件并输入实验的温度曲线。在加载和分析产品样品之前，始终运行一些标准样品，如氯化钾或氯化钠，以确保温度传感器已校准且发现结果可靠。
3.2.2.冻干显微镜的应用
3.2.2.1.结晶系统
在结晶系统的情况下，配方中包含可结晶的辅料，其预期作用是提供结晶基质，除了提高整体塌陷温度外，必须确保其在冻结阶段完全结晶。需要注意的是，结晶系统的塌陷温度的确定应在可结晶辅料（例如，甘露醇）完全退火后进行。如果系统主要是结晶性质的，则塌陷温度将是共熔温度。为了实现可结晶辅料的完全结晶，应确定发生最大结晶动力学的温度和时间，FDM有助于实现这一点。实验程序应首先在低于配方的Tg’至少6–10°C的温度下冻结样品，以创建晶核，然后再退火。为了确定最佳温度，将温度提高到大约高于Tg’值10°C，以提供核的移动性和生长到晶体中，并以2°C的增量缓慢提高温度，同时在每个温度增量处保持15–20分钟以观察结晶生长速率。一旦确定了发生最大生长的退火温度，然后确定完全结晶所需的时间，作为冻结溶液中更高塌陷温度的证据。在FDM上确定的退火时间和温度在小瓶中表现良好，并且可以进一步优化。下面提供了一个通常用于确定结晶系统塌陷温度的冷却和加热曲线示例：
1.以10°C/min的速率降至-45°C
2.在-45°C保持5分钟
3.以0.25°C/min的速率升至-15°C
4.在-15°C保持180分钟（退火步骤）
5.以10°C/min的速率降至-45°C
6.在-45°C保持
7.施加真空
8.以5°C/min的速率加热至-35°C
9.以2°C/min的增量加热，并在每个温度处保持5分钟，观察干燥过程中结构的丧失/当结构开始部分破裂时称为部分塌陷，完全破裂时称为完全塌陷/共熔，直至0°C。类似的冷冻协议可以在MDSC上使用，以获得基于甘露醇或甘氨酸的配方的热行为，如图8所示。
图 8 在 MDSC 上确定结晶系统热事件的示意图
3.2.2.2.案例研究
非晶态系统
确定纯辅料（如蔗糖或海藻糖）的塌陷温度并不困难，因为它们的值在文献中是已知的，只需要仔细注意干燥前沿/升华前沿，因为它接近已知的文献值。这将是一个很好的非晶态系统标准，用于在进行任何涉及非晶态系统塌陷温度测定的实验之前检查温度探头/传感器的校准。有时如果盖玻片没有正确放置在石英坩埚上，溶液会从边缘挤出，中心留下一层非常薄的层，使观察变得困难。此外，挤出的蔗糖或海藻糖在边缘干燥/结晶，使真空穿透盖玻片变得困难，并抑制干燥，将不会看到升华前沿。在图9a中，你可以清楚地看到蔗糖结构在-31°C左右开始破裂，以及在任何高于此温度的温度下完全塌陷，在图9b中，你可以看到2%的棉子糖在-24°C开始塌陷，在-21°C完全塌陷。添加缓冲盐或其他辅料会对配方的整体塌陷温度和Tg'产生正面或负面影响，这取决于辅料的性质。例如，图10下面描绘了由于添加或存在Tris，蔗糖的塌陷温度降低到-37°C。
图 9 (a) 10% 蔗糖的示例。(b) 2% 棉子糖的冷冻干燥显微图像 (A) 在 -24°C 时开始塌陷 (B) 在 -21°C 时完全塌陷
图 10 含有蔗糖：Tris的配方溶液的冷冻干燥显微图像
同样，可以在图11中的MDSC热图上看到，由于添加了缓冲盐（在这个例子中，溶液含有Tris、磷酸盐、PEG和精氨酸），纯海藻糖的Tg'值从-30°C降低到-48°C。然而，有一些辅料，如环糊精和蛋白质，添加后将对配方的整体塌陷产生积极影响。有一些最低浓度要求才能开始看到积极效果。例如，蛋白质的添加只有在浓度高于20mg/mL时才会产生积极效果，如下所示。这在图12和表4中有所说明。此外，通常观察到从开始到完全塌陷在几度温度内连续过渡，而不是明显的塌陷行为，这主要是由于蛋白质浓度高。
图 11 纯海藻糖和含有 Tris、磷酸盐、PEG 和精氨酸的配方溶液的热图
图 12 冷冻干燥显微图像照片，展示蛋白质浓度对 (a) 20 mg/mL 蛋白质在海藻糖配方中和 (b) 100 mg/mL 蛋白质在蔗糖配方中塌陷温度的影响
观察到结构最初变化的温度被称为Tc,on（开始塌陷或部分塌陷），而观察到完全失去结构（塌陷）时被称为Tc,com。从图11和表4中可以有趣且重要地注意到，不仅开始温度和塌陷结束或玻璃转变结束之间的差异或宽度随着蛋白质浓度的增加而显著增加，而且Tg'值和塌陷温度之间的差异也增加。在某些情况下，特别是高蛋白质浓度配方，粘性流动直到开始温度13-14°C时才被观察到。因此，始终谨慎/建议使用FDM来确定给定配方在主干燥期间的上限温度，而不是仅仅依赖于DSC数据。
此外，对于高蛋白质浓度配方，可以并且可以利用优势在Tg'以上和Tc,on略高处进行主干燥，而没有缺乏优雅和稳定性的证据。这是基于假设，在高蛋白质浓度下，固体是密集/紧密排列的，从而增加粘度并限制流动性，导致在冷冻干燥的时间尺度下防止宏观塌陷。
3.2.2.3.晶态系统
如上所述，始终谨慎校准系统与标准，氯化钠和氯化钾是确定共晶熔点温度的良好标准，因为它们的共晶熔点温度已知分别为-21°C和-11°C。它们是各向同性的，具有立方晶体晶格结构，其中所有的钠或钾和氯离子都沿三个相互垂直的轴均匀排列，这意味着你不会看到双折射，正如你可以看到的水或甘露醇或甘氨酸或方解石一样，因为它们是各向异性的。在配方中，如果所有的辅料都是可结晶的，并且在冷冻时结晶，那么塌陷温度将是共晶熔点温度(Te)。由于Te远高于Tc，通过创建以晶态组分为主要组分的配方来利用优势，这将使产品温度在Tg'以上但低于Te进行主干燥，从而显著缩短冻干过程。在这种情况下，产品将在晶态相表面的非晶态组分塌陷时干燥，而晶态相将为蛋糕结构提供必要的机械支撑，但必须评估对产品稳定性的影响。另一方面，如果非晶态相构成主要组分，而晶态相为次要组分，那么在这些情况下Te不会是塌陷温度。可结晶的辅料不会结晶，因为主要的非晶态组分会抑制其结晶过程，可结晶的辅料将保持大部分非晶态，并对配方的整体塌陷温度做出贡献。纯甘露醇的Te在-3°C到-5°C之间。当添加像蔗糖这样的糖时，根据重量比，甘露醇的结晶被抑制，并将保持非晶态，必须使用FDM确定塌陷温度。甘露醇的退火或热处理将影响塌陷温度。例如，在一个含有甘露醇、蔗糖和蛋白质的配方中，甘露醇是主要组分，未退火时的塌陷温度被确定为-20°C到-23°C。然而，优化退火条件（时间和温度）导致确定最佳退火条件，在此条件下塌陷温度从-23°C提高到-9°C，如图13和14以及表5所示。
图 13 在甘露醇和蔗糖中配制的单克隆抗体溶液的冷冻干燥显微图像
图 14 优化退火温度和时间以提高在甘露醇和蔗糖中配制的单克隆抗体溶液的 Tg’值
在有无氯化钠的情况下，对含有海藻糖和甘露醇的配方进行了冷冻干燥显微镜检查，以比较盐对冷冻干燥过程关键温度的影响，特别是对塌陷事件的影响。该分析显示了这两种条件下塌陷温度(Tcol)之间的显著差异，正如预期的那样。如图15所示，无氯化钠样品的Tcol为-24.1°C，含氯化钠样品的Tcol为-35.4°C。由于盐具有低Tg'值，即使低浓度的氯化钠(0.2% m/v或34 mM)也能显著降低Tg'值。当产品温度在冻干过程中超过Tg'值时，刚性玻璃会变软，变成一种高粘度的橡胶状材料并发生塌陷。
图 15 重组人凝血因子 IX 配方溶液的冷冻干燥显微图像，含有海藻糖和甘露醇 (a) 加 NaCl (b) 和不加 NaCl。观察到塌陷开始的温度分别为 -35.4°C 和 -24.1°C。使用的退火条件为 -10°C 10 分钟。
可以使用Fox方程从单相多组分体系中各个组分的Tg'值估算最大冻融浓缩物的玻璃转变温度(Tg')，如方程3所示。
其中W1是组分1的重量分数，Tg1是纯组分1的玻璃温度。由于Fox方程适用于多组分系统，如果将方程3中的Tgi识别为水相组分i的Tg'，Wi是溶质相对于溶质总质量的重量分数，则可以从方程中估算出第二种溶质组分对配方Tg'的影响。如图16所示，甘氨酸对水相蔗糖系统Tg'的影响与方程3一致，其中水相甘氨酸的Tg'值是通过将数据拟合到Fox方程获得的，因为甘氨酸在冷冻时容易结晶，很难确定其Tg'值。
图 16 甘氨酸对非晶态蔗糖 Tg’的影响：甘氨酸冷冻系统。
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