BioArt按
：
博落回属于罂粟科植物，最早记载于唐朝陈藏器所著《本草拾遗》中，其“治恶疮，瘿根，赘瘤，肉，白癜风，蛊毒，溪毒”显示具有抗菌、杀虫、消炎活性，近年来因博落回提取物作为替代饲用抗生素产品开发而进入人们视野，引起国内外的研究热潮，目前Sangrovit®和“美佑壮”博落回提取物产品已畅销45个国家。随着欧洲、美国已将抗生素作为促生长剂退出市场，“中国2020遏制耐药性计划”也启动了退出方案。如何寻找成本低、效果好的替代品成为行业迫切的需求，博落回作为后抗生素时代的新饲用抗生素替代产品而广受国内外的推崇。随着新一代高通量测序技术的兴起，许多重要的动植物已进行了基因组测序，从而推动其基础研究和产业发展。湖南农业大学
曾建国
教授带领的研究团队于2010年首次在国际上启动了首个罂粟科植物-博落回全基因组计划，该团队经过6年的努力与国内外诸多单位联合攻关，率先破译了博落回基因组，该成果以“The genome of the medicinal plant Macleaya cordata provides new insights into benzylisoquinoline alkaloids metabolism”（全基因组视野下揭示博落回中异喹啉生物碱合成代谢）为题于7月5日以长篇幅研究论文（Research Article）的形式在
Molecular Plant
杂志上在线发表。
博落回基因组图谱的成功绘制揭示了博落回苄基异喹啉类生物碱的生物合成途径基因的确证，必将加快旨在提高博落回高产、优质、广适应性新品种的选育与培育和血根碱的生物制造带来可能，将会带动其分子育种在内的基础研究，为低成本的获得原料的国家饲用替抗战略提供新选择。
鉴于该成果的重要意义，邓兴旺教授、陈万生教授和漆小泉研究员对这项研究分别给予了很高的评价。
论文解读
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20世纪50年代以来，随着抗生素的发现，低剂量抗生素在饲料中的添加使用曾为动物的健康养殖做出了巨大的贡献，但是随着抗生素用量的增加和滥用导致耐药性和超级病菌的出现，对环境和公众健康产生了潜在的严重威胁。为此，自1986年瑞典首个宣布全面禁止抗生素作为饲料添加剂以来，欧盟2006年1月起，全面在饲料中禁止使用抗生素，美国2017年起也禁止抗生素在饲料中用于促生长为目的，我国农业部也计划自2020年起将饲用抗生素逐步退出添加剂市场。因此寻找一种“安全、有效、可控、成本低”的饲用替抗产品是目前全球研究的热点。
抗生素生长促进剂（AGPs）已被欧盟禁止用于动物饲养，而天然生长促进剂（NGPs），如植物来源产品则被广泛地用于家畜生产中希望作为抗生素的替代品。由于
血根碱
具有抗炎活性并促进动物生长，使得学术界和工业界都对他们有极大的兴趣。目前，含有血根碱的产品在45个国家广泛销售。来自于美国中东部和东部的血根草(
Sanguinaria canadensis
)曾经是血根碱生产的主要来源植物，但它已被列为了濒危保护植物，虽然罂粟科的罂粟（
Papaver somniferum
）也能够生物合成血根碱，但众所周知的原因显然不可能从中获取。因此，迫切需要为血根碱供应找到新的原料来源。
博落回
(
Macleaya cordata
(Willd.)R.Br.)和
小果博落回
（
Macleaya microcarpa
(Maxim.)Fedde）系罂粟科多年生高大草本，别称号筒杆等，主要分布在中国、东南亚、北美和欧洲并且作为一种传统中药使用了很长时间（
图2
）。在中国，博落回作为药用植物已经有1000多年的历史并被唐朝《本草拾遗》等收录。由于该植物中产生了高含量的有抗菌活性的苄基异喹啉生物碱（BIAs），如血根碱(SAN)，白屈菜红碱 (CHE)，小檗碱（BBR）, 原阿片碱（PRO）和别隐品碱（ALL），而且完全不含有成瘾性的吗啡和可待因。因此，
博落回和小果博落回是替代血根来作为工业生产血根碱的理想来源，其主要富含生物碱的部位为果荚
。
图2.博落回植物外形及主要结构
该属植物主要分布在中国大部分地区，每年果荚的产量超过上千吨。目前，博落回市场前景广阔，已被列入了欧洲食品安全局(EFSA) 的动物饲料添加剂组成名单并广泛地应用于动物饲料添加剂生产。德国Phytobiotics公司Sangrovit®产品原料来自中国已经在欧盟作为无抗饲料的核心原料销售多年，其主要成份血根碱具有抗炎活性并且促进动物生长功能。博落回中的季铵类苯并啡啶生物碱还具有调控动物肠道菌群作用，在欧洲应用于清洁能源沼气生产调节剂; 在美国，博落回来源的植物源农药温室花卉杀菌剂QWEL®已经获EPA批准注册；在中国，博落回已成为多种类型的抗炎、抗癌和外用制剂的开发对象，湖南美可达生物资源股份有限公司开发的博落回散（美佑壮）于2012年底成功注册成为我国首个二类新中兽药药物饲料添加剂产品。临床试验证明，博落回散对猪、鸡、水产具有很好的抗炎、维护肠道健康与促进生长作用。博落回中异喹啉类生物碱还具有抗炎作用，与血根碱结构很相似的小檗碱（也称黄连素）就通常用来治疗痢疾和肠炎，我国科学家赵立平教授和蒋建东教授等对小檗碱的肠道调节以及降糖降脂等作用有深入研究。
虽然博落回的产品在饲用替抗产品全球市场取得了骄人的成绩，产品已非常丰富和畅销，但是博落回作为一种尚未规模化种植的野生资源，药材种植成本高急需定向培育高血根碱优良品种或通过微生物代谢工程低成本获得血根碱。
天然活性成分在植物中含量的高低直接决定了植物材料中分离和纯化的成本，如目前对博落回野生资源的采集方式不仅破坏了该植物资源的存储量且需要大量的时间和很高的成本。而利用化学方法进行合成的难度也很大并且成本也非常高，且面临环境污染的风险。因此，要实现资源的可持续利用和降低生产成本就必须要借助植物和微生物代谢工程的方法进行生产，而前提是植物中的合成代谢通路必须清楚。
图3. 转录组，蛋白质组和代谢组数据的整合揭示博落回与小果博落回中生物碱生物合成
2013年，曾建国教授团队完成“转录组，蛋白质组和代谢组数据的整合揭示博落回与小果博落回中生物碱生物合成”研究，通过10个在不同时间，不同组织器官和不同种样本的转录组，蛋白质组和代谢数据对博落回属植物的生物碱生源合成可能的机理进行了探索（
图3与图4
）。通过对博落回转录组数据组装和聚类之后从博落回与小果博落回两个种分别得到了69367 和 78255条 unigenes。该研究对于控制生物碱代谢通路中酶的关键基因的表达进行了多层次的比较和分析并且通过对转录组数据注释找到了血根碱合成通路中所有功能基因的同源基因，为博落回属植物血根碱通路功能基因克隆提供了前期基础数据。
图4 博落回转录组学，蛋白质组学和代谢组学整合分析
2014年，曾建国教授参与中国农科院蔬菜花卉研究所黄三文研究员团队的工作，在
Science
杂志上发表黄瓜苦味形成机理研究成果后又于2016年在
Nature Plants
上发表“葫芦科作物苦味性状的趋同驯化与差异进化”（
图5
）将大数据应用到葫芦科作物的次生代谢研究，为该科作物味觉品质性状改良，甚至为源自甜瓜或西瓜中的原料药葫芦素B的植物定向制造提供了可能。在获得以上的成功后，曾建国教授团队就运用大数据分析结合多重组学继续深入研究博落回中活性化合物SAN的合成通路与相关基因。
图5. 葫芦科作物苦味性状的趋同驯化与差异进化
随着新技术的出现和价格的大幅降低，基因组测序已经成为未开发的非模式生物中植物代谢研究的有力研究工具，同时也是植物中生物合成关键酶和基因簇发现的基础手段。为了研究从多个罂粟科物种中发现的SAN和CHE生源合成途径是否也完整的存在于博落回植株中以及挖掘其功能基因，曾建国教授研究团队通过异喹啉类生物碱的质谱裂解规律结合LC-Q/TOF MS技术对博落回植株中生物碱进行了定性分析，并通过化学合成、从博落回植物中分离以及购买等方式获得中间体的对照品进行结构确证，然后以
13
C
6
-苯环标记的酪氨酸饲喂博落回组培苗进行同位素示踪，除标记到SAN和CHE生源合成通路上所有的中间体外以期发现更多的与之相关的生物碱，如基于修饰组产生的类似化学合成的副产物（
图6
）。
图6 异喹啉类生物碱（血根碱和白屈菜红碱）在博落回体内的代谢途径
早在2010年曾教授团队就开始与北京诺禾致源公司合作对博落回的全基因组进行了
De novo
测序，并且于2012年完成了博落回全基因组测序。作为首个获得并公开发表全基因组数据的罂粟科植物，该测序采用第二代HiSeq2000高通量测序平台对博落回6个180bp-10kb不等插入片段的基因组文库进行测序，产生长度为100bp的Pair-end序列达256.5Gb（约466.4x基因组覆盖），通过19-Kmer分析表明博落回基因组大小为540.5Mb，杂合率为0.92%，预测22,328个蛋白质编码基因。在博落回中，共发现10,302个基因家族存在于所有3个真双子叶植物基部中，极可能代表了真双子叶植物基部的“核心”蛋白质组。其中，33个直系同源家族（包含148个基因）是3个基部双子叶植物特有的（博落回、耧斗菜和莲花）。
该研究结果揭示了具有定义基部双子叶植物进化分支的关键创新相关功能的原始基因的起源。
在基因组中，基因家族大小的变化体现了物种形成的重要机制具有重要意义。在博落回的33,797个基因家族中有479个的大小发生了显著变化，其中28个发生了显著扩张。其中最值得关注的是二氢苯并菲啶氧化酶（DBOX）是负责生成血根碱的最后一个催化步骤的酶，该基因的基因家族大小在博落回基因组（35个DBOXs基因）中显著扩张，而在莲花中大小为9，在耧斗菜中为4，在葡萄中为1，在拟南芥中为10，在水稻中为5，这一现象与博落回产生丰富的次生代谢产物密切相关。
全基因组复制（WGD）现象在陆地植物基因组中非常常见，几乎所有的已测序真双子叶植物基因组中都可以检测到大约发生在1.25亿年前的古多倍化事件。然而，对博落回的基因组分析表明，古多倍化事件事件不存在，该结果进一步证实了双子叶植物基部可能没有经历古多倍化事件这个推测。对葡萄和博落回之间的共线性区域分析发现，葡萄中区域通常对应于博落回中的两个同源区，并且博落回中的区域对应于葡萄中的3个同源区域，这意味着博落回可能存在额外的特异性的全基因组复制事件。
图7 博落回基因组和基因家族进化分析
完成基因组测序后该团队并没有急于发表, 而是通过与黄三文研究团队和北京师范大学林魁老师团队合作，进一步整合基因组、转录组和代谢组数据继续深入挖掘博落回中合成血根碱的功能基因。同时还获得了中科院上海植生所陈晓亚院士的指导和帮助。
1.多重组学发现博落回中SAN和CHE合成通路基因
通过结合之前博落回的代谢组学研究发现博落回中参与血根碱合成基因的共表达模式应该是在根部组织和果荚中高表达，茎部组织低表达甚至不表达。为了验证这一结论，他们对博落回的根、茎、叶、花、果荚5个组织进行了转录组分析，并通过这一表达模式遴选出16个基因（
图7
），并使用酿酒酵母异源表达方法确证了其中14个基因参与了SAN和CHE的生物合成。虽然参与血根碱合成的相关基因之前已经在不同罂粟科物种中被验证（如罂粟、花菱草等），但是在一个物种中仅验证了合成中的几步。而曾教授团队此次通过博落回全基因组数据在博落回中一次性验证了合成通路中的十几步，这说明通过结合基因组数据能加速功能基因的挖掘。
图8. A.博落回中根、茎、叶、花、果中4种生物碱含量 B.博落回中参与合成SAN和CHE基因的共表达模式图。
2. 证实博落回P6H酶是已知同类酶中转化原阿片碱生成血根碱效率最高的酶
目前国际上已有一些科研团队正在利用一些罂粟科的功能基因信息构建工程菌生产BIAs生物碱的工作，如Smolke研究团队通过将来源于罂粟、花菱草、日本黄连等植物中合成BIAs的功能基因以不同组合形式整合到酵母基因组中来筛选出最高产量的生物碱组合；Jay D. Keasling在酵母中合成青蒿素重要前体青蒿酸，他们均是将植物中的功能基因转入到微生物生物中实现了异源表达生产。但是由于罂粟和花菱草等植物的生物信息数据有限以及这些植物功能酶异源表达催化效率低等因素影响了工程菌的商业化生产。而博落回作为罂粟科家族中首个完成全基因组测序的物种，其生物信息数据可以对参与BIAs合成的功能基因进行更细致的研究，也为遴选催化效率更高的功能基因提供了新的基因资源。因此，曾教授团队对一些参与血根碱合成的关键基因的催化效率进行了进一步的研究。在这些酶中，原阿片碱 6-羟化酶（P6H）苯并啡啶氧化酶是参与合成血根碱的关键酶，该酶能够将血根碱的重要前体物质原阿片碱转化成二氢血根碱，目前所有已研究结果中，加州罂粟（Papaver californicum）的P6H催化效率最高。通过在酵母中饲喂前体原阿片碱后检测二氢血根碱含量进行催化效率比较，发现博落回P6H基因能够在酵母中产生比加州罂粟P6H更多的二氢血根碱。而进一步结合酵母中两种P6H酶的蛋白质表达分析显示博落回P6H酶在酵母中的表达量低于加州罂粟P6H酶却能产生更多的二氢血根碱，证实了博落回的P6H酶是已知同类酶中催化效率最高的（
图9
）。
图9.比较不同植物物种P6H的催化能力
3. 首次证实Battersby提出“网脉荔枝碱”合成路径的正确性
众所周知网脉荔枝碱是异喹啉类生物碱生源合成的关键中间体，20世纪60年代Battersby等科学家根据体外实验结果认为在植物中网脉荔枝碱的生源合成是以全去甲劳丹碱为前体经2步氧甲基化和1步氮甲基化催化反应生成；但20世纪80年代后Stadler和Zenk等科学家修正了Battersby之前的结果，他们是基于在高等植物中未检测到网脉荔枝碱生源合成前体全去甲劳丹碱（s-norlaudanosoline），去甲网脉荔枝碱（s-norreticuline）和6-O-甲基全去甲劳丹碱（s-6-O-methylnorlaudanosoline）这3种化合物，以及对罂粟和花菱草多个物种的同位素示踪研究结果最终认为网脉荔枝碱的正确合成途径应该是由去甲乌药碱（s-norcoclaurine）经2步氧甲基化反应，1步氮甲基化反应和1步羟基化反应生成。但是曾教授团队首次在博落回植物中检测到全去甲劳丹碱，去甲网脉荔枝碱和6-O-甲基全去甲劳丹碱这3种物质的存在，并且通过酵母异源表达验证了从全去甲劳丹碱开始最终合成网脉荔枝碱的功能功能基因，为高等植物中网脉荔枝碱的生物合成提供了新的解释（
图10
）。
4.发现博落回血根碱生源合成新旁路
除此以外，该团队还通过LC-MS和同位素示踪以及质谱裂解规律从博落回中推断出在两个新化合物N-甲基金黄紫堇碱和
N
-甲基碎叶紫堇碱，并从中分离出生物碱以及通过核磁共振确证了其结构。基于同位素标记
N
-甲基金黄紫堇碱和
N
-甲基碎叶紫堇碱结构特征和已有血根碱生源合成途径，推测出博落回中可能存在的血根碱生源合成新旁路，即从金黄紫堇碱经
N
-甲基金黄紫堇碱和
N
-甲基碎叶紫堇碱生产
N
-甲基刺罂粟碱的旁路，并通过酵母异源表达试验验证了从金黄紫堇碱合成
N
-甲基金黄紫堇碱的功能基因。
5. 基因组水平解释博落回中不存在吗啡
虽然博落回是罂粟科植物但是体内并不含有吗啡和可待因等成瘾性物质，而分析发现博落回基因组中不存在参与合成吗啡和可待因的同源基因，这一发现也从基因组水平解释了博落回为何不含有吗啡和可待因的原因并且进一步证实了博落回可以作为血根碱供应的安全来源。
基因组学、转录组和代谢组研究结果显示博落回中除了存在保守的BIAs代谢途径外还可能存在血根碱生源合成新旁路。该研究成果为降低血根碱生产成本提供了可能并通过系统解析博落回中血根碱生源合成途径，为培育高血根碱含量的博落回品种和构建生物合成血根碱的工程菌提供了新的理论指导，为降低血根碱生产成本提供了新方法，同时也为其他药用天然产物生源合成途径以及相关功能基因的挖掘提供了借鉴。
图10. 血根碱以及白屈菜红碱生源合成通路图（绿色以及红色部分代表可能存在的旁路）
本项成果多家单位合作并获得了国家自然科学基金尤其是湖南美可达生物资源股份有限公司的大力资助。湖南农业大学博士生
刘秀斌
、
柳亦松
博士、博士生
黄鹏
、中国农业科学院蔬菜花卉所博士生
马永硕
、湖南中医药大学博士生
卿志星
、湖南农业大学
唐其
博士及北京师范大学博士生
曹慧芬
为论文共同第一作者，湖南农业大学
熊兴耀
教授、云南师范大学马铃薯科学研究院
尚轶
研究员、中国农业科学院农业基因组研究所
黄三文
研究员和湖南农业大学
曾建国
教授为共同通讯作者。
专家点评：
邓兴旺
（北京大学教授，美国耶鲁大学终身教授，美国科学院院士）
Comments
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植物天然产物可被开发成药物（包括兽药）、饲料添加剂、香料、色素和植物源农药等产品，蕴含了巨大的商业价值。药用植物博落回可以合成具有抗菌、抗炎活性并具促生长功能的血根碱，但不合成吗啡和可待因。湖南农业大学曾建国教授的团队长期致力于从博落回中开发饲用替抗产品，并在全球市场取得了骄人的成绩。然而，博落回作为一种尚未规模化种植的野生资源，种植成本高，急需定向培育高血根碱优良品种或通过微生物代谢工程低成本获得目标化合物。
随着基因组、转录组等大数据的广泛应用，通过多种学科交叉融合加速植物天然产物基础研究和产业开发的例子已在多种植物中得以验证，这对于研究工具匮乏的非模式植物尤为重要。中国农业科学院农业基因组研究所黄三文研究员的团队前期积累了丰富的多组学植物代谢产物研究经验，并在黄瓜和番茄中率先实现了“从基因组到品种”的设想。通过团队间密切合作首次揭示了罂粟科植物基因组，为从全基因组水平系统发掘血根碱代谢通路创造了条件，共遴选出16个基因，并一次性确证了其中14个合成酶的功能，进一步完善了植物中异喹啉类生物碱生源合成的代谢网络。
揭示血根碱代谢网络仅仅是第一步。以基因组数据为基础，有望进一步揭示参与生物碱合成的转运蛋白，这是该研究领域未解的重要科学问题，而上述研究中已发现了非常明确的线索。此外，博落回参考基因组也为下一步进行博落回种质和遗传群体重测序、基因关联分析与挖掘、人工驯化及定向培育高血根碱含量的博落回品种提供了契机，也为构建生物合成血根碱的工程菌提供了新的理论指导。
陈万生
（第二军医大学附属长征医院药学部主任，国家杰出青年科学基金获得者）
Comments
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药用植物次生代谢产物尤其是活性成分的生物合成途径解析是资源品质改良、微生物代谢工程生物制造的前提和基础。博落回目前已作为饲用抗生素替代产品被成功开发成中兽药，逐渐成为重要的兽用中药资源。湖南农业大学的曾建国教授研究团队经过6年努力与联合攻关，率先破译博落回基因组，并系统解析了其异喹啉生物碱合成代谢途径，该研究为降低血根碱生产成本提供了可能，为培育高血根碱含量的博落回品种和构建生物合成血根碱的工程菌提供了理论指导，并为异喹啉类生物碱的生物制造奠定了基础，必将加速旨在提高博落回高产、优质、广适应性新品种的培育和血根碱的生物制造及基础研究进程；同时该研究也为其他药用天然产物生源合成途径解析以及相关功能基因的挖掘提供了借鉴。该团队在中兽药领域取得如此前瞻性的创新成果，实属可贵。我还特别留意到该团队的学术交叉氛围及对关键科学问题的专注，该团队聚焦支撑产业的基本需要，在获得全基因组数据基础上重点进行了有效成分合成途径功能基因的挖掘研究，这种将生物合成代谢置于全基因组视野下的研究方法更突显该团队开展野生变家种中药材种质优化的创新研究思路。向曾建国教授团队表示祝贺！
