为了探讨Wnt/β-catenin在人多发性硬化症和小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中所发挥的作用,本文作者主要分三个层次进行研究:效应,机制,机制验证。
在效应阶段主要回答了Wnt/β-catenin是否在人多发性硬化症和小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发挥作用,以及在此过程中起作用的Wnt配体是什么。
采用TCF/LEF1::H2B-eGFP Wnt reporter 转基因小鼠,检测Wnt以及Wnt下游分子Apcdd1
和Y-box 17定位及在健康和EAE小鼠不同表达情况,结果见下图。实验结果证明在EAE形成过程中,Wnt/β-catenin通路在中枢神经系统血管中被激活。
Wnt/β-catenin通路发挥作用通常需要配体的支持,在本文中作者检测一系列Wnt配体包括Wnt3,Wnt5a,Wnt7a,Wnt3。发现Wnt配体Wnt3和Wnt5a随着Wnt通路活性增强而增强。
在机制阶段,由于相关研究指出β-catenin的活化可能调节细胞连接,而在EAE形成和发展中,细胞连接被破坏。因此作者收集已发生EAE的C57BL/6J小鼠脊髓,检测细胞连接相关相关蛋白的表达情况。发现在wnt/β-catenin通路的活性与细胞连接破坏相关。
此外,在效应阶段已证实wnt/β-catenin在血管中表达升高,那么wnt/β-catenin是否通过影响脉管系统调节影响多发性硬化症呢?为了回答这一问题,作者检测wnt/β-catenin下游SOX17的表达,发现在多发性硬化症中SOX17表达显著升高。结果表明,在多发性硬化症发生时,wnt/β-catenin通路在内皮细胞的血管中再活化。
在回复实验阶段,作者建立了过表达Wnt抑制因子Axin的转基因小鼠模型(dTg),并在该小鼠模型中诱导EAE后收集脊髓进行相关实验。结果显示,在Wnt抑制的小鼠模型dTg中,EAE分数显著增加,生存率显著降低。此外,作者还检测细胞连接相关蛋白(Cadherin-5, β-catenin, Claudin-5, Occludin, ZO-1,AJ和TJ)的表达。发现Wnt通路抑制不影响细胞连接。
此外,作者还发现在dTg小鼠中,CD4+细胞数明显增加,脊髓髓鞘区域面积显著降低。因此,Wnt通路活化显著增强免疫细胞浸润和脱髓鞘能力。进一步的,作者检测发现免疫细胞浸润能力增强是由于VCAM-1表达升高引起的。
最后,考虑到CAV-1和Cavin-2在BBB连接和脱髓鞘中的作用,作者检测dTg小鼠中二者的表达,结果显示CAV-1含量显著升高。而CAV-1胞吞蛋白Albumin-Alexa594蛋白的表达也增加。以上实验结果表明,抑制Wnt通路活化增强VCAM-1和Cav-1的表达,促进CD4+T细胞浸润。
参考文献:Endothelial Wnt/β-catenin signaling reduces immunecell infiltration in multiple sclerosis