独家 |“CRISPR-Cas9魔剪”失灵了？谷峰：三大操作问题或为脱靶“元凶”

基因 编辑 ， 最早 起源 于 荣获2007年 诺贝尔生理医学奖 的 基因打靶技术。 美国犹他大学医学院的马里奥-R-卡佩奇(Mario R.Capecchiand)、英国卡迪夫大学医学院的马丁-J-伊文思(Martin J.Evans)和北卡罗莱纳大学医学院的奥利弗-史密西斯(Oliver Smithies)三位科学家的一系列重大研究突破，让小鼠中的基因打靶技术得以问世。

小鼠基因打 靶 ， 是 将一段外源序列 插入 小鼠 胚胎 干细胞中， 替换 小鼠胚胎干细胞 的 特定 基因 。 由于该技术能实现基因定点改造，因而具有巨大应用潜力，对整个生命科学与医疗研究价值重大。但 经典 的 基因打靶效率非常低，阳性概率是 10 ^-5 ~10 ^-6 ，只有百万分之一 ，让学科发展受到 严重 阻碍。

后来发现新的基因编辑工具， 锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，是 一种人工改造的核酸内切酶。 锌指结构存在于大部分的转录因子蛋白中，能特异结合到基因启动子区，所以ZFN是锌指蛋白与核酸内切酶 Fok1 的融合产物 ， 能在各种复杂基因组的特定位置切割形成双链切口。

该酶出现意义非凡， 美国Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化， 推动 了科研应用 与发展。 但由于ZFN仍有不少缺陷，比如结合DNA存在很强不确定性， 5年 后又诞生新一代基因编辑工具 TALEN， 它具有结构简单，特异性更高、成本低廉的优点，很大程度上替代了ZFN。 TALEN技术灵感 起源 于 抗病水稻 ， 发现植物细菌蛋白TAL的氨基酸序列与靶位点的核酸序列具有一一对应关系，由此构建出能靶向定位的重组核酸酶TALEN。

2013年初 ， 最 新 一 代 的 人工核酸内切酶 横空出世 ， 它 就是 CRISPR/C as9 技术。 当时美国两个实验室，MIT的华人科学家张峰和哈佛医学院的George Church的研究团队同时在Science上发文，证明CRISPR编辑能在真核细胞中发挥作用，由此奠定重要的应用研究基础。

文章发表后引起业内轰动， CRISPR-C as9 结构更 简单，只需两个组件， C as9 蛋白 和 s g RNA序列， 打靶的sgRNA引导Cas9核酸酶在基因组（包括iPS基因组）的特定位点上进行切割与修饰。DNA双链断裂后，自身会修复，如果有意人为引入修复模板，就能纠正特定基因。

因为操作 简单，花费 更少，CRISPR技术很快 普及开来， 在此基础上，全球实验室做了大量工作，分别从细胞系、动物水平以及iPS水平进行基因组的特定编辑，科研成果也相继发表在Science，Nature biology和Cells等知名期刊上。

现在，CRISPR/Cas9技术已分别在患有杜氏肌营养不良、B型血友病和PRKAG2心脏综合征的小鼠模型中成功发挥疗效，并在感染的哺乳动物乙肝细胞中删除了病毒DNA，这些实验的成功表明“CRISPR魔剪”有望治疗人类相关疾病。

至于近期报道的基因编辑引发上千突变的热议文章， 谷峰 博士 解释，该 实验 方法 是为基因缺陷小鼠进行基因治疗，将疾病小鼠的受精卵取出来，注射 C as9 蛋白 ， sgRNA是 以质粒形式注射 进去 ， 外加 修复模板 。 修复后采用全基因组测序方法进行检测，在两个小鼠体内发现1736个单碱基突变和1696个碱基突变。

这样 操作有 几 个问题 ， 一是 行业公认做法是将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，得到转基因动物模型， 但该 实验 是注射质粒形式的 sgRNA， 对此操作产生一点疑问；第二是 注射受精卵后，因为受精卵会分裂很容易产生嵌合体，也容易产生错误结果。 在 遗传病治疗方面， 一般 很少用受精卵 ， 受精卵仅用于科研，实际治疗中几乎无用。 最后 ， 靶 点选择问题 ，如果不使用经典的PAM（NGG），敲除效率也会降低， 而且 注射剂量 ，如酶的过量使用都会造成脱靶。所以对于引发上千个基因突变的实验结果，研究人员应该认真分析实验设计与操作。

谷峰博士认为， 降低脱靶率 的 策略还有寻找长序列 PAM，提高 保真力 ，选择 高保真的 C as9 并 采用双缺口酶策略 是 目前解决脱靶的最好方案。

以上根据谷峰博士演讲整理部分精华，完整版请点击阅读原文即可