科研 | 江南大学&贺州学院：铁皮石斛多糖对秀丽隐杆线虫抗衰老的剂量依赖性作用（国人佳作）

DOP由于其丰富的生物活性，作为一种对各种疾病的饮食干预手段，已获得了广泛的关注。在本研究中，DOP的产量和纯度分别为18.65%和80.33%，这与先前的研究结果相似。多糖的分子量（Mw）与其生物活性密切相关。具体来说，分子量较高的多糖分子内部纠缠更多，这会减少活性基团的暴露并降低其抗氧化能力。相反，分子量过低会抑制特定活性结构的形成，从而降低其生物活性。分子量超过100 kDa的多糖具有较高的生物活性。在本研究中，计算出DOP的分子量为324.54 kDa（图1A），这与先前报告的结果一致，即DOP的分子量范围在291 kDa至730 kDa之间。这些结果表明，本研究中的DOP分子量适中，这与其生物活性相关。Pang等人研究了DOP的分子量对秀丽隐杆线虫（ C. elegans ）抗氧化活性和抗肥胖特性的影响。他们的研究结果表明，分子量为214.97 kDa的DOP（处于中等范围）相较于分子量为507.65 kDa、125.41 kDa和16.07 kDa的DOP变体，展现出更优越的抗氧化和抗衰老特性。

DOP主要由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）组成，其摩尔比为73.47:25.67:0.66:0.19，其中甘露糖和葡萄糖约占DOP总量的99%（图1B），这与先前的研究结果相似。根据傅里叶变换红外光谱（FT-IR）图（图1C），DOP中的大多数官能团均按照先前的研究进行了归属。具体来说，3390.2 cm ⁻ ¹处的宽而强的谱带对应于O–H伸缩振动，而2931.3 cm ⁻ ¹处的峰则是CH ₂ 基团的C–H伸缩振动的特征。DOP光谱中1735.6 cm ⁻ ¹、1415.5 cm ⁻ ¹和1249.6 cm ⁻ ¹处的谱带分别代表羰基（C=O）的伸缩振动、–CH ₃ 基团的–CH振动和C–O振动，这表明存在-O-COCH ₃ 基团。1060.7 cm ⁻ ¹和1029.8 cm ⁻ ¹处的显著峰归因于吡喃糖形式中C–O的弯曲振动模式。约810 cm ⁻ ¹和870 cm ⁻ ¹处的吸收带分别由甘露糖吡喃糖环的同相环伸缩和赤道C2–H键的变形引起。此外，810 cm ⁻ ¹和874 cm ⁻ ¹处的谱带也被特定地归属于甘露聚糖，因此被一些研究人员称为“甘露聚糖谱带”。我们的结果证实了DOP中存在甘露聚糖结构。

DOP的三螺旋结构测定结果如图1D所示。与纯刚果红相比，刚果红在碱性溶液中能与三螺旋多糖形成特定的复合物，导致最大吸收波长（λmax）发生红移。当NaOH溶液的浓度在0.0至0.3 mol/L范围内时，DOP与刚果红复合物的λmax发生红移，而当NaOH溶液的浓度超过0.3 mol/L时，λmax减小，这表明DOP在弱碱性范围内具有三螺旋结构。多糖的三螺旋构象通常被认为与其生物活性有关，如抗衰老和免疫调节活性。

我们使用大肠杆菌（ E. coli ）OP50的OD600值来量化秀丽隐杆线虫可获得的食物浓度。将秀丽隐杆线虫暴露于62.5、125和250 mg/L的DOP中，其食物消耗率与对照组相比无显著差异（图2A， p > 0.05）。然而，与对照组相比，在1000和2000 mg/L的DOP浓度下，在所有测量的时间点食物消耗量均显著降低（ p < 0.0001）。对于暴露于500 mg/L DOP的组，我们仅在48小时前观察到食物消耗量显著减少（ p < 0.01），而在此之后与对照组相比无显著差异。这些结果表明，62.5、125和250 mg/L的DOP浓度不会对秀丽隐杆线虫的食物摄入产生不利影响，因此这些浓度适用于后续的寿命测定。

为了评估DOP在秀丽隐杆线虫中的抗衰老特性，首先必须确定DOP的最佳浓度范围。值得注意的是，食物摄入量显著影响秀丽隐杆线虫的寿命，例如，已知饮食限制能延长多种动物模型的寿命。此外，已报道多糖水平升高对秀丽隐杆线虫摄食行为的影响。例如，Sun等人发现，人参残渣中高含量的多糖会显著降低秀丽隐杆线虫的食物摄入量。因此，我们首先评估了DOP对食物清除率的影响，以确定DOP的最适浓度范围。在先前的研究中，研究者测试了一系列药物稀释度，最高药物浓度是根据最大溶解度确定的。在本研究中，我们选择了2000 mg/L作为DOP的最高浓度，这是基于先前已知在秀丽隐杆线虫中具有健康益处的有效剂量，从而确保实验中所使用的DOP浓度是合理的。

为了明确DOP对寿命的影响，在标准生长条件下，我们将处于同步L4期的秀丽隐杆线虫暴露于不同浓度的DOP中。生存分析显示，与对照组相比，接受125 mg/L（ p < 0.05）和250 mg/L（ p < 0.01）DOP处理的组生存曲线显著向右移动（图2B）。这种移动表明，这些浓度的DOP有效延长了线虫的寿命，而62.5 mg/L的DOP则没有产生显著影响（ p > 0.05）。对照组线虫的平均寿命为15.54 ± 0.95天。DOP给药后，DOPL（62.5 mg/L）、DOPM（125.0 mg/L）和DOPH（250.0 mg/L）组的平均寿命分别增加了6.93%（16.62 ± 0.94天）、17.82%（18.31 ± 1.01天）和26.24%（19.62 ± 1.15天）。此外，在氧化应激和热应激条件下，DOP也表现出类似的延长寿命特性（图2C和D）。在H ₂ O ₂ 应激条件下，对照组线虫的平均寿命为3.65 ± 0.36天（图2C）。DOP给药后，DOPL、DOPM和DOPH组的平均寿命分别增加了31.58%（4.81 ± 0.48天）、48.42%（5.42 ± 0.49天）和75.79%（6.42 ± 0.55天）。值得注意的是，在正常衰老和应激诱导衰老中，DOP剂量与线虫寿命之间呈线性正相关，R²值超过0.9（图2EG， p < 0.05）。此外，与正常衰老和热应激诱导衰老相比，在氧化应激条件下，DOP的延长寿命效果更为显著（ p < 0.001），这表明DOP的抗氧化特性可能在其抗衰老作用中发挥关键作用。

Okoro等人研究了100、200和500 mg/L浓度的DOP对秀丽隐杆线虫寿命的影响，结果显示200 mg/L的浓度相较于其他测试浓度对延长寿命具有更有利的影响。Tang等人评估了在氧化应激条件下，250、500和1000 mg/L浓度的DOP对秀丽隐杆线虫寿命的影响。结果表明，500 mg/L的浓度对延长寿命的影响最为有益，其次是250 mg/L的浓度，而1000 mg/L的浓度在秀丽隐杆线虫中表现出最不利的影响。此外，DOP对增加抗氧化酶活性以及上调daf-16、skn-1和sir-2.1基因表达的影响也呈现出类似的趋势。这些发现表明，延长寿命与DOP剂量之间的关系并非简单的线性关系。虽然较高剂量的多糖对延长寿命的影响并非严格线性，但在较低的DOP水平下，寿命的延长似乎与剂量呈线性相关。这种细致的剂量-反应关系强调了优化DOP浓度对其潜在抗衰老益处的重要性。因此，在本研究中，DOP的低浓度范围（62.5–250 mg/L）对寿命表现出了剂量依赖性影响。