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分子诊断，这篇全帮你总结好了！

体外诊断价值圈 · 公众号 · · 2025-01-17 08:47

正文

分子诊断技术是用分子生物学方法针对人体及各种病原体的遗传物质的表达及结构进行检测，从而达到预测及诊断疾病的目的。

近年来，随着分子诊断技术的升级迭代，分子诊断的临床应用越来越广泛和深入，分子诊断市场进入快速发展期。

笔者总结市场上常见的分子诊断技术，分为上中下三篇， 上篇介绍 PCR 技术，中篇介绍核酸等温扩增技术，下篇介绍测序技术 。

上篇：PCR技术

PCR 技术

PCR (polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应，是体外 DNA 扩增技术之一，至今已经超过 30 年的历史。

PCR 技术于 1983 年由美国 Cetus 公司的 KaryMullis 首创， 1985 年 Mullis 申请了 PCR 专利，同年在 Science 上发表了第一篇 PCR 学术论文，1993 年 Mullis 因此获得了诺贝尔化学奖。

PCR基本原理

PCR 可以将目标 DNA 片段扩增一百万倍以上，其原理是在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。

标准 PCR 过程分为三步：

1.变性（ Denaturation ）：利用高温使 DNA 双链分离。 DNA 双链之间的氢键在高温下（ 93- 98 ℃）被打断。

2. 退火（ Annealing ）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链 DNA 上。

3. 延伸（ Extension ）： DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着 DNA 链合成互补链，延伸完成，则完成一轮循环， DNA 片段数增加一倍。

往复循环这三个步骤 25-35 次， DNA 片段数将得到指数级增加。

PCR 的巧妙之处在于针对不同的目标基因可以设计不同的引物，使目标基因片段在短时间内得到百万级的放大。

目前为止， PCR 可以分为三类，分别是普通 PCR 、荧光定量 PCR 和数字 PCR 。

第一代普通 PCR

采用普通 PCR 扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，只能做定性分析。

第一代PCR主要缺点：

容易发生非特异性扩增和假阳性结果。
检测耗时长，操作繁琐。

只能做定性检测。

第二代荧光定量 PCR

荧光定量 PCR （Real-Time PCR），也叫做qPCR，通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累，通过荧光曲线来判断结果，并可以借助 Cq 值和标准曲线来定量。

qPCR 技术由于操作过程在封闭体系中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为 PCR 中的主导技术 。

实时荧光定量 PCR 所使用的荧光物质可分为：TaqMan荧光探针、分子信标和荧光染料。

1)TaqMan 荧光探针：

PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR 扩增时， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。

2)SYBR 荧光染料：

在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 SYBR 仅与双链 DNA 进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定 PCR 反应是否特异。

3) 分子信标

是一种在 5 和 3 末端自身形成一个 8 个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。

PCR 产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA 序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

第二代PCR主要缺点：

灵敏度还有欠缺，低拷贝标本检测不准确。
存在背景值影响，结果易受干扰。
当反应体系中有 PCR 抑制物时，检测结果易受干扰。

第三代数字 PCR

数字 PCR （DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通过终点检测计算目标序列的拷贝数，无需采用内参和标准曲线即可进行精确的绝对定量检测。

数字 PCR 采用终点检测，不依赖于 Ct 值（循环阈值），所以数字 PCR 反应受扩增效率的影响降低，对 PCR 反应抑制物的耐受能力提高，具有很高的准确度和重现性。

由于具备高灵敏度、高精确度的特点，不易被 PCR 反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，而成为研究和应用热点。

根据反应单元的不同形式，主要可分为 微流体式、芯片式和微滴式 三大类系统。

1) 微流体数字 PCR ， Microfluidic digital PCR ， mdPCR 。

基于微流控技术，对 DNA 模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与 PCR 反应体系结合， mdPCR 已逐渐被其他方式取代。

2) 微滴数字 PCR ， Droplet-based digital PCR ， ddPCR 。

利用油包水微滴生成技术对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。

以伯乐的 ddPCR 为例，主要包括三个步骤：

第一，准备样本和生成微滴 ，如下图， 8x3 的微孔板，一排加样本，一排加油滴，通过微滴生成器每个样本生成 20000 个微滴。

第二，进行“油包水” PCR ，把微孔板放入 PCR 扩增仪，对每个微滴进行 40 个热循环的 PCR 反应。

第三，读取微滴结果 ，把微孔板放入读取仪，通过流式细胞技术获取每个微滴 PCR 终点结果的荧光信号，并用泊松分布原理纠正结果。

Bio-rad 去年上市的 Bio-Rad QX ONE 数字 PCR 系统整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤，最大程度减少人工操作。

配备四个独立的荧光检测通道，结合 ddPCR 特有的高阶多重 PCR 技术，可以在单反应孔中实现 8 重拷贝数变异 ( CNV ) 检测、 5 重突变检测或 4 重基因表达检测。

3) 芯片数字 PCR ， Chip-baseddigital PCR ， cdPCR 。

利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动，将样本液体分成大小一致的纳升级于反应孔种进行数字 PCR 反应，实现绝对定量。

以法国 Stilla technologies 公司的 cdPCR 技术为例，主要包括以下步骤：

第一，加样和生成微滴： 将样本和 PCR 反应液加入微流控芯片，放入仪器中，仪器可通过物理方法生成单层平铺的 20000~30000 个微滴阵列。

第二，对每个微滴进行 PCR 扩增： 在 Naica Geode 微滴生成扩增系统自动进行 PCR 扩增。

第三，读取和分析结果： 将芯片置于 Prism 微滴读取分析系统上进行荧光信号采集，计数阴阳性微滴，通过泊松分布计算获得靶标基因绝对拷贝数浓度。

总结一下，将样本和 PCR 反应液加入微流控芯片，放入仪器中，通过物理方法生成单层平铺的微滴阵列，随后对每个微滴进行扩增，然后进行六通道荧光信号采集，计数阴阳性微滴，通过泊松分布计算获得靶标基因绝对拷贝数浓度。

第三代PCR主要缺点：

仪器和试剂昂贵。
模板质量要求较高，模板量超过微体系量将导致无法定量，过少则定量准确度降低。
当存在非特异性扩增时也会产生假阳性。

PCR 的各种延伸技术

1.递减 PCR （ touchdown PCR ）：前几循环温度逐渐下降。

2.逆转录 PCR （ RT-PCR ）：以由 mRNA 逆转录而来的 cDNA 为模板，也因为是从表现型基因来进行增量的，由此产生出来的 cDNA 产物不带有内含子（基因中不具意义的段落），常应用于分子克隆技术。

3.热启动 PCR （ hotstart PCR ）：以高热激活型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。

4.巢式 PCR （ nested PCR ）：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。

5.多重 PCR （ multiplex PCR ）：在同一个管中使用多组引物。

6.复原条件 PCR （ reconditioning PCR ）： PCR 产物稀释 10 倍后重新放入原浓度的引物和 dNTP 等循环 3 次，以消除产物中的异二聚体。

7.dsRNA 合成（ dsRNA replicator ）：合并使用 high-fidelity DNA polymersae 、 T7RNA 聚合酶与 Phi6 RNA replicase ；从双股 DNA 转录为对应的双股 RNA （ dsRNA ）。可应用于 RNAi 实验操作。

8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR): 用以检测突变或特殊等位基因的 PCR 应用技术。

参考文献：

1.刘婉彤等，分子诊断技术的临床应用进展

2.杨柳等，非鳞非小细胞肺癌基因检测技术研究进展

3.G.Terrance Walker,etc. Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique

3.各公司官网

中篇：核酸等温扩增技术

本篇介绍一下等温扩增技术。

PCR是使用最为广泛的核酸扩增技术，以其灵敏性、特异性得到广泛应用，然而PCR需要反复的热变性，无法摆脱依赖仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。

自20世纪90年代初，很多实验室开始发展无需热变性的恒温扩增技术，现已开发出环介导等温扩增技术、链替代等温扩增技术、滚环等温扩增技术、依赖核酸序列等温扩增技术等技术。

环介导等温扩增

环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification ， LAMP) 是由日本荣研公司的 Notomi 等于 2000 年首先提出来的新的核酸扩增技术。

基于该技术，荣研还曾和国内某公司引起专利纠纷。

其扩增原理是基于 DNA 在 65 ℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。

DNA 在此温度下利用 4 条特异性引物依靠一种链置换 DNA 聚合酶，使链置换 DNA 的合成不停地自我循环。

先确定目标基因上的 6 个特异性区域 F3 、 F2 、 F1 、 B1 、 B2 、 B3 ，然后依据这 6 个特异性区域设计 4 条引物（如下图）：

正向内引物 (forwardinner primer ， FIP) ，由 F1c 和 F2 组成。

反向内引物 (backwardinner primer ， BIP) ，由 B1c 和 B2 组成，中间均以 TTTT 作为间隔。

外引物 F3 、 B3 分别由目的基因上的 F3 、 B3 区域组成。

在 LAMP 反应体系中，内引物的浓度几倍于外引物的浓度。内引物先与模板链结合合成互补链，形成 DNA 双链。随后外引物再与该模板链结合，形成 DNA 双链，在 BstDNA 聚合酶的作用下，释放出由内引物合成的互补链，该互补链经过一系列反应最终形成具有哑铃结构的 DNA 单链。

以哑铃结构 DNA 单链自身为模板不断形成一端开口的过渡性茎环结构 DNA ，由内外引物引导过渡性茎环结构 DNA 不断发生链置换延伸反应，最后形成具有多个茎环结构的长度不一的 DNA 混合物。

环介导等温扩增的优势与不足

LAMP 的优势：

（ 1 ）扩增效率高，能够在 1h 内有效的扩增 1-10 个拷贝的目的基因，扩增效率为普通 PCR 的 10 倍 -100 倍。

（ 2 ）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。

LAMP 的不足：

（ 1 ）对引物的要求特别高。

（ 2 ）扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断。

（ 3 ）由于其敏感性强，容易形成气溶胶，造成假阳性，影响检测结果。

链置换扩增

链置换扩增（ strand displacement amplification,SDA）是美国学者 Walker 于 1992 年首次提出的一种基于酶促反应的 DNA 体外等温扩增技术。

SDA 的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶、两对引物、 dNTP 以及钙、镁离子和缓冲系统。

链置换扩增其原理是基于在靶 DNA 两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链 DNA 打开缺口， DNA 聚合酶延伸缺口 3 ’端并替换下一条 DNA 链。

被替换下来的 DNA 单链可与引物结合并被 DNA 聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。

链置换扩增技术的优势与不足

SDA 的优点：

扩增效率高，反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。

SDA 的不足：

产物不均一，在 SDA 循环中总要产生一些单、双链产物，用电泳法检测时必然会出现拖尾现象。

滚环核酸扩增

滚环核酸扩增（ rolling circle amplification, RCA ）是通过借鉴病原生物体滚环复制 DNA 的方式而提出的，指在恒温下以单链环状 DNA 为模板，在特殊的 DNA 聚合酶（比如Phi29）的作用下，进行滚环式 DNA 合成，实现目标基因的扩增。

RCA 可分为线性扩增与指数扩增两种形式，线性 RCA 的效率可达到 10 ⁵ 倍，而指数 RCA 的效率可达到 10 ⁹ 倍。

简单区分，如下图，线性扩增 a 只用 1 条引物，指数扩增 b 则有 2 条引物。

线性 RCA 又称为单引物 RCA ，一条引物结合到环状 DNA 上，在 DNA 聚合酶作用下被延伸，产物为单环长度数千倍的大量重复序列的线状单链。

由于线性 RCA 的产物始终连接在起始引物上，所以信号易于固定是它的一大优势。

指数 RCA ，也被称作超分支扩增 HRCA(Hyper branched RCA) ，在指数 RCA 中，一条引物扩增出 RCA 产物，第二条引物与 RCA 产物杂化并延伸，置换已经结合在 RCA 产物上的下游引物延伸链，反复进行延伸和置换，产生树状的 RCA 扩增产物。

以 4BaseBio 公司的 TruePrime 滚环扩增试剂盒为例，使用 TthPrimPol 引物酶和 Phi29DNA 聚合酶，实现了无需添加引物即可进行扩增。

滚环核酸扩增的优势与不足

RCA 的优势：

灵敏度高，特异性好，易操作。

RCA 的不足：

信号检测时的背景问题。在 RCA 反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板 DNA 或者 RNA 可能产生一些背景信号。

依赖核酸序列的扩增技术

依赖核酸序列的扩增技术（ nucleicacid sequence-based amplification, NASBA ）是在 PCR 基础上发展起来的一种新技术，是由 1 对带有 T7 启动子序列的引物引导的连续、等温的核酸扩增技术，可以在 2h 左右将模板 RNA 扩增约 10 ⁹ 倍，比常规 PCR 法高 1000 倍，不需特殊的仪器。

该技术一出现就被用于疾病的快速诊断，目前有不少公司的RNA检测试剂盒都用此方法。

尽管 RNA 的扩增也可以使用反转录 PCR 技术， NASBA 相比则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行，相对传统的 PCR 技术更为稳定、准确。

反应在41摄氏度下，需要 AMV （ avian myeloblastosis virus ）逆转录酶、 RNA 酶 H 、 T7 RNA 聚合酶和一对引物来完成。

其过程主要包括：

正向引物包含 T7 启动子互补序列，反应过程中正向引物与 RNA 链结合，由 AMV 酶催化形成 DNA-RNA 双链。

RNA 酶 H 消化杂交双链中的 RNA, 保留 DNA 单链。

在反向引物与 AMV 酶的作用下形成含有 T7 启动子序列的 DNA 双链。

在 T7 RNA 聚合酶的作用下完成转录过程，产生大量目的 RNA 。

NASBA 的优势：

（ 1 ）它的引物上带有 T7 启动子序列，而外来双链 DNA 无 T7 启动子序列，不可能被扩增，因此该技术具有较高的特异性和灵敏度。

（ 2 ） NASBA 将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。

NASBA 的劣势：

（ 1 ）反应成分比较复杂。

（ 2 ）需要 3 种酶使得反应成本较高。

参考文献：

1.姜苏 , 李一荣，等温扩增技术的原理及应用

2.彭涛，核酸等温扩增技术及其应用

3.赵璐瑶等，基于环介导核酸等温扩增的快检技术研究

4. England biolabs, Loop Mediated Isothermal Amplification.

5.G.TerranceWalker etc. Strand displacement amplification isothermal, in vitro DNA amplification technique.

6.吴晓亮等，DNA的滚环扩增技术研究进展。

7.各公司官网。

下篇：测序技术

本篇作为分子诊断技术全解析的最后一篇，介绍一下测序技术。

基因测序技术始于 1977 年， sanger 发明的 DNA 双脱氧末端终止测序法拉开了序幕。 Sanger 在 1958 年和 1980 年因为胰岛素测序和 DNA 测序而两度获得诺贝尔化学奖，是第四位两度获得诺贝尔奖以及唯一获得两次诺贝尔化学奖的人。

Sanger 测序

Sanger 测序采用四个双脱氧核糖核酸 (ddNTP) 加入到正在合成的链上，由于双脱氧核糖核酸少了一个氧原子，一旦被加入到 DNA 链上，反应即终止。

通过构建四个反应体系，加入 AGCT 四种双脱氧核糖核酸，同时调节脱氧核糖核酸 (dNTP) 和 ddNTP 的相对浓度，可以使反应扩增得到几百至上千碱基的终止产物。

随后通过凝胶电泳对产物进行分离，分为四个泳道，每个泳道对应一种碱基，然后读取条带显影结果。

该方法因准确率高，被称为基因检测的金标准，但是耗时长，成本高。

2001 年人类基因组计划就是采用 sanger 测序完成的，从 1990 年人类基因组计划建立开始，全球的科学家历时 11 年耗资 30 亿美元完成。

进入 21 世纪后，随着物理及化学技术的发展，开始采用相同激发波长但不同发射波长的荧光集团来标记 ddNTP ， ATGC 对应不同的荧光基团产生不同颜色的光被计算机读取，测序的速度和效率大大提高。

二代测序

第二代测序技术也称高通量测序（ high-throughput sequencing ， HTS ）技术，相对于一代测序，它可以实现大规模平行测序，基本原理是将基因组分割成短片段，对短片段测序再进行拼接。

对比第一代测序技术拥有着高通量、低成本等优势，目前相同数据量的检测，其成本约为一代测序技术的 0.01% ，极大地推动了测序技术在临床检测方面的应用。

2005 年 454 公司基于焦磷酸测序法推出了 Genome Sequencer 20 System(GS 20) 系统，开启了高通量测序的进程。 2007 年，罗氏公司收购了 454 ，并推出了一系列性能更优的 NGS 系统，极大的提升测序通量和准确性。

尽管具有读长优势，但是测序通量和成本始终限制了 454 平台的推广，同样数据量下成本约是 illumina 的 100 倍，因此罗氏在 2016 年底终止了 454NGS 测序相关的业务。

2006 年 Solexa 公司推出了 Genome Analyzer 系统，包括 DNA 簇、桥式 PCR 和可逆阻断等技术，这使得 GA 系统在高通量、低成本、应用范围广等方面具有明显优点。 2007 年， Illumina 公司收购了 Solexa 并发布二代测序仪。

二代测序经过这些年的发展已经步入成熟期，目前市场上根据测序技术可以可以把二代测序平台分为 4 类：边合成边测序法（ Illumina ）、半导体测序法（ ThermoFisher ）、联合探针锚定聚合测序法 ( 华大智造 ) 和焦磷酸测序法。

Illumina边合成边测序

Illumina 测序的流程主要包括样品制备，簇生成，测序，数据分析。

首先是样本制备和建库。用 DNA 或 RNA 抽提试剂盒提取核酸，然后用超声波将其随即打断成 90-250bp 左右的长度或者控制全部 DNA 在一定长度范围内。

为了后续的扩增和测序，需要在这些 DNA 片段加入特定的序列。如下图，分别是与流动池引物互补结合的区域（ P5 、 P7 ）、与 Read 1 和 read 2 测序引物结合的区域（ Rd1SP ， Rd2 SP ）以及标签序列区域 Index 。

添加完接头序列的 DNA 合集称为 DNA 文库，这样就完成了建库，该步骤可以采用商业化的文库制备试剂盒完成。

第二步是成簇 Cluster Generation 。

成簇是上述 DNA 片段被扩增的过程，该过程在流动池 (Flow cell) 中完成。流动池是一种含有 8 个通道的厚玻璃片，每条通道中都随即植入了能与文库接头 P5 或 P7 互补结合的短 DNA 片段。

首先引物和流动池的固定 DNA 片段互补配对，固定在通道表面，然后在 DNA 聚合酶作用下 DNA 链进行互补延伸形成 DNA 双链。通过变性，其中的单链被洗脱，剩下的一条单链会与旁边的固定接头链接，形成单链桥。

同样的，单链桥在 DNA 聚合酶作用下延伸配对形成双链桥，通过变性形成 2 条单链，这两条单链又分别与旁边的固定引物结合，形成 2 个单链桥。重复这个循环，最终形成数百万的 DNA 簇。

上述过程所有的 DNA 片段都会被扩增，扩增结束后，反向连会被切断洗脱，只留下正向链，为防止互补结合重新形成单链桥， 3 ‘端被封锁。

第三步，测序。

首先，在流动池中加入荧光标记的 dNTP 和酶，由引物起始开始合成子链。由于 dNTP 存在 3 ’端叠氮基会阻碍子链延伸，因此每个循环只能测得一个碱基。合成完一个碱基后，洗掉多余的 dNTP 和酶，使用激光扫描获得荧光信号。

随后加入试剂将叠氮基团与荧光基团切除，然后流动池再通入荧光标记的 dNTP 和酶，由引物起始开始合成一个碱基。不断重复这个过程，完成第一次读取。

所有的 DNA 片段的一个碱基会被同时读取，在大规模并行的过程中，机器读取的图像类似下面这样：

同时，加入了不同的 index 来区分每个样本及正负链。在完成第一次读取后，复制出的链会被洗去， index 片段引物被引入并与模板杂交，完成序列读取后被洗去。这样读取到的序列与开始时已知的 index 比对后就可以给测得的序列贴上标签，方便后续分析。

Paired-end 测序已经是现在的主流，要完成双末端测序，首先要将模板链

分子诊断，这篇全帮你总结好了！

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