基于UPLC-MS的吴茱萸汤对虚寒呕吐大鼠血清代谢谱的影响

呕吐是临床上常见症状，表现为上腹部特殊不适感，常伴有头晕、流涎、脉缓、血压降低等迷走神经兴奋症状 ^[1] 。多种疾病如运动病、内耳眩晕症、消化道疾病等中均存在该症状，部分患者因难以忍受剧烈呕吐而中断或放弃治疗。因此，如何解决呕吐成为众多医家关注的焦点。

吴茱萸汤是源自张仲景《伤寒论》的经典名方，证见厥阴之胜、耳鸣头眩、愦愦欲吐、胃膈如寒 ^[2] 。该方由吴茱萸、人参、生姜、大枣 4 味中药组成，具有温胃补虚之效，用于治疗胃气虚寒所致阳明寒呕、少阴吐利、厥阴头痛 ^[3] 。人参价格昂贵，历代医家多以党参代之，其功效与人参相近，在该方中与人参配伍意义大致相同 ^[4] 。方中吴茱萸既可散寒降逆止呕，又能疏肝解郁温胃；党参补气健脾，温中补虚；生姜温胃散寒降逆，与吴茱萸相辅相成；大枣温中补虚，君臣佐使合用，共奏可散可降，又温又补之功 ^[5] 。课题组前期研究表明，吴茱萸汤对虚寒呕吐有较好的改善作用 ^[6-7] 。

代谢组学是系统生物学研究的重要组成部分，分析技术具有高通量、高灵敏度、高精确度的特点，使生物体内源性代谢物质的变化规律与疾病的生理病理变化相契合 ^[8] 。代谢组学研究思路具有整体性、动态性和系统性的特点，与中医学的哲学思想具有一致性 ^[9] 。因此，本研究采用超高效液相色谱 - 质谱（ UPLC-MS ）技术结合代谢组学，观察虚寒呕吐模型大鼠血清代谢组学的变化，以期从代谢组学角度阐明虚寒呕吐证的物质基础，为中医证本质研究提供生物学基础，为阐明吴茱萸汤治疗虚寒呕吐的作用机制提供思路。

1 材料

1.1 药材

吴茱萸、党参、大枣、大黄饮片均购于北京同仁堂（集团）有限责任公司，生姜购于北京东直门菜市场，经中国中医科学院中药研究所隋峰研究员鉴定，均符合《中国药典》 2015 年版规定。吴茱萸汤和大黄水煎液按照文献方法提取 ^[7] 。经 HPLC 多成分含量分析 ^[13] ，吴茱萸汤主要含黄酮和皂苷类化合物，其中含主要活性成分吴茱萸碱 0.245 mg/kg 、吴茱萸次碱 0.13mg/kg 、吴茱萸内酯 8.95 mg/kg 、芦丁 0.43 mg/kg 、 6- 姜辣素 0.95 mg/kg ，符合相关要求。

1.2 试剂与仪器

顺铂（质量分数≥ 99.99% ，批号 15663-27-1 ）购自美国 Sigma 公司；甲醇、甲酸、甲酸铵、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，购自 ThermoFisher Scientific 公司。

88700V 型 −80 ℃ 冰箱、 UltiMate 3000 型超高效液相色谱仪、 Q-Exactive 型质谱仪均购自 Thermo Fisher Scientific 公司； DV215CD 型电子分析天平购自德国赛多利斯公司； MS304TS/02 型电子天平购自瑞士梅特勒 - 托利多公司； Milli-QAdvantageA10 型超纯水仪购自美国 Millipore 公司； X-30R 型离心机购自美国 Sigma 公司。

1.3 动物

SD 雄性大鼠 30 只， 6 ～ 8 周龄，合格证号 SCXK （军） 2012-0004 ，体质量（ 200 ± 20 ） g ，购自军事医学科学院，饲养于中国检验检疫研究院实验动物中心。大鼠适应性饲养 1 周后进行实验。动物实验操作过程依照中国检验检疫研究院实验动物中心伦理委员会的要求执行。

2 方法

2.1 分组与给药

将大鼠随机分成对照组、模型组、吴茱萸汤（ 20 g/kg ）组，每组 10 只，单笼饲养。对照组大鼠 ig 生理盐水，其余两组大鼠 ig 大黄水煎液（ 10mL/kg ， 1 mL 含 1 g 生药量）， 0.5 h 后吴茱萸汤组 ig 吴茱萸汤（ 20 mL/kg ， 1mL 含 1 g 生药量）， 1 次 /d ，连续 15 d 。对照组大鼠分别于第 1 、 10 天 ip 生理盐水注射液（ 2 mL/kg ） ，其余各组 ip 顺铂（ 30 mg/kg ，以生理盐水配制成质量浓度为 15 mg/mL 的溶液）， 1 次 /d 。从第 7 天开始，各组大鼠用饲料与高岭土混合饲养 ^[7] 。

2.2 血清样本的收集与制备

末次给药后所有大鼠禁食不禁水 24 h ，腹主动脉取血， 3 500 r/min 离心 15 min ，分离血清，于 −80 ℃ 保存。分析前冰浴复融，取 50 µL 血清，精密加入乙腈 450µL ，涡旋 30 s ， 13 000 r/min 离心 15 min ，上清液进样检测。

2.3 血清分析的检测条件

2.3.1 色谱条件 Thermo Syncronis C ₁₈ 色谱柱（ 100 mm × 2.1 mm ， 1.7 µm ），流动相 A 为含 0.1% 甲酸的 2 mmol/L 甲酸铵水溶液，流动性 B 为乙腈，梯度洗脱： 0 ～ 1 min ， 95% A ； 1 ～ 25 min ， 95% ～ 5% A ； 25 ～ 30 min ， 5% A ，体积流量 0.4 mL/min ，进样量 3 µL 。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ ESI ），采用正、负离子同时扫描模式，电喷雾电压 2.8 kV ，鞘气体积流量为 1.05 × 10 ⁴ mL/min （ 35 arb ），辅助气体积流量为 3 × 10 ³ mL/min （ 10 arb ），毛细管温度 320 ℃ ，一级全扫描，分辨率 70 000 ，数据采集范围 m / z : 50 ～ 1 050 ，二级数据依赖性扫描（ full MS/dd-MS ² ），分辨率 17 500 ，阶梯归一化碰撞能分别为 20 、 40 、 60 eV ^[6] 。

2.4 数据处理及分数据

采用 mzCloud 对内源性代谢物质进行鉴定，包括分子式、相对分子质量、二级碎片离子等，同时在 TraceFinder 3.2.0 软件自建内源性物质 ^[10] ，并分别在 Metlin 数据库、人类代谢组数据库（ HMDB ） ^[14] 、京都基因与基因组百科全书（ KEGG ）数据库 ^[15-16] 中进行检索和确认。数据采用 MetaboAnalyst 3.3.0 进行主成分分析（ PCA ）、偏最小二乘法 - 判别 分析（ PLS-DA ）、拓扑分析，使用 R 统计软件包 R × 643.2.4 （ http://cran.r-project.org ）进行高通量代谢通路分析 ^[17] 。 利用 Cytoscape 3.3.0 、 MetScape 、 MCL 、 MCODE 插件绘制内源性物质网络图模块化分析。

3 结果

3.1 大鼠血清的检测

模型组大鼠血清样品的总离子流色谱图见图 1 。

3.2 血清代谢组学的初步分析

用无监督的 PCA 对对照组和模型组之间的差异进行分析，如图 2-A 所示，各组数据的聚类情况较好，无可剔除的样本。为了获取更加理想的组间分离并增强对分类贡献大的变量的识别，进一步对对照组、模型组、吴茱萸汤组进行有监督的 PLS-DA ，如图 2-B ～ C 所示，在各组样本血清的 PLS-DA 得分图中，各组的样本点相分离，且各样本点在一定范围内聚集较好，说明建模后，大鼠机体正常的生理代谢被干扰，从生理代谢物的变化层面也可认为虚寒呕吐模型建立成功。模型的估计模型的预测能力（ Q ² ）＝ 0.812 （ R ² X ＝ 0.975 、 R ² Y ＝ 0.924 ），吴茱萸汤组与模型组分开，但有向对照组靠近的趋势，说明与模型组的偏离情况相比，吴茱萸汤组有所改善。

3.3 潜在生物标志物的验证及鉴定

3.3.1 潜在生物标志物的验证 通过改变诊断临界值，获得多对灵敏度与特异度值，以灵敏度为横坐标，（ 1 －特异度）为纵坐标，绘制受试者工作特征曲线（ ROC ），然后利用 ROC 曲线下面积来评价诊断效率 ^[18-19] 。如图 3 所示，差异性代谢物曲线下面积均大于 0.9 ，说明通过 PLS-DA 处理后，筛选出的差异性代谢物具有较高的准确性。

3.3.2 潜在生物标志物的鉴定 采用 “ 2.4 ” 项方法得到 1 个 30 血清样本× 126 变量的数据矩阵。在 PLS-DA 模型中提取 VIP 值最大的前 48 个变量（ VIP ＞ 1.0 ） ，这 48 个变量的载荷矩阵图距原点比较大的距离。通过对目标变量进行手动积分，并综合 VIP 值、非参数检验和 ROC 曲线的精密度（＞ 0.5 ）来筛选差异代谢物，确定 35 个变量为代谢标志物， 其质谱数据信息如表 1 、 2 所示。与对照组相比，模型组中 5- 羟基色胺、棕榈油酸、三甲基胺氧化物等 16 个化合物相对离子强度明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；胞嘧啶、脯氨酸、月桂酸等 19 个化合物相对离子强度明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。经吴茱萸汤干预后，上述 35 个差异性代谢物均有向正常水平靠近的趋势，说明吴茱萸汤对这些差异性代谢物具有一定的调节作用。

3.4 潜在生物标志物的通路分析

利用 MetaboAnalyst 3.3.0 对 35 个差异性代谢物进行代谢通路的富集分析，选择 KEGG 数据库，通路影响值的临界值设定为 0.10 ，高于这个值，则认为是潜在的靶标路径，如图 4 、表 3 所示，共得到亚油酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、花 生四烯酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨基酰基 - tRNA 生物合成、 D - 组胺和 D - 谷氨酸代谢 6 条相关的潜在代谢通路。表明在造模过程中上述