TET 甲基胞嘧啶双加氧酶（TET1、TET2 和 TET3）一直被认为通过氧化 DNA 中的 5-甲基胞嘧啶（5mC）来调控多种生物系统中的基因表达。其中，TET2在髓系恶性肿瘤中表现出显著的高突变率【1】，而在癌症中常见的异柠檬酸脱氢酶（IDH） 突变也被认为主要通过抑制 TET2 发挥作用【2】。与它作为DNA 5mC去除器的功能相反，TET2 缺失导致基因组 DNA 低甲基化以及活跃转录，这表明 TET2 缺失所导致的染色质变化可能与其 DNA 氧化活性无主要关联。在蛋白序列上，TET2 在 TET 酶中也是独特的，因为它没有与锌指 CXXC 结构域蛋白 CXXC4 或 CXXC5共价连接；TET2 与 CXXC4/5 的相互作用对于 TET2 的 DNA 结合至关重要【3】。在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，有研究表明 TET2 通过结合 RNA 结合蛋白 PSPC1 来介导 RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）的氧化并调控相关逆转录转座子【4】。其他研究也报道了由 TET2 或果蝇 TET 同源物介导的 RNA m5C 氧化【5】。近几年来，何川课题组和其他研究组报道了染色质相关 RNA（caRNA）上可逆的 N6-甲基腺苷（m6A）修饰可以调控染色质状态【6-9】。那么caRNA上的m5C对染色质状态会不会也有类似调控作用呢？为了解析TET2如何抑制活跃的DNA转录状态与白血病发生，2024年10月2日，来自美国芝加哥大学的Chuan He(何川)教授与美国德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心 (University of Texas Health Science Center at San Antonio) Mingjiang Xu（徐明江）教授带领团队在Nature杂志以RNA m5C oxidation by TET2 regulates chromatin state and leukaemogenesis为题发表了他们最新的研究成果，他们发现，染色质相关的逆转录转座子 RNA m5C可以被甲基化-CpG-结合域蛋白 MBD6 识别，后者引导附近组蛋白 H2A 上的单泛素化赖氨酸 119（H2AK119ub）的去泛素化，从而促进开放的染色质状态。TET2 氧化 m5C 并拮抗这种 MBD6 依赖的 H2AK119ub 去泛素化。因此，TET2 缺失导致染色质 H2AK119ub 减少，染色质更加开放，干细胞中的转录增加。TET2 突变的白血病细胞依赖于该基因激活途径，而 MBD6 的缺失选择性地阻断了 TET2 突变白血病细胞的增殖，并在体外和体内大部分逆转了 TET2 缺失引起的造血干细胞分化的缺陷。
首先，作者们研究了Tet1敲除（KO）和Tet2 KO的小鼠胚胎干细胞并发现Tet2 KO导致了染色质开放和更多的caRNA的表达。研究者们进一步通过m5C甲基化RNA免疫沉淀对caRNA中的m5C位点进行了研究并发现它们主要存在于逆转座子RNA中。而这些m5C修饰的逆转座子RNA附近的染色质在Tet2 KO细胞中变得更开放。高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）对caRNA的分析也显示出Tet2 KO细胞中m5C升高，而其氧化产物hm5C降低。超快定量亚硫氢酸盐测序（Ultrafast bisulfite sequencing，UBS）针对caRNA的分析显示出长末端重复序列（LTR）中的IAP和长散布核元件-1（LINE-1）亚群在Tet2 KO细胞中显示出最明显的m5C水平升高。针对性的在IAP上利用失活Cas13（dCas13）和TET2的催化结构域对RNA m5C进行氧化可以在短时间内使附近染色质进入更加关闭的状态，这一点也和其在DNA 5mC上的功能不同。因此，对caRNA m5C的氧化可能在TET2影响染色质构象与基因表达中起到主要作用。为了了解这一过程的分子机制，作者们分析了Tet2 KO细胞中DNA 5mC的变化。DNA 5mC升高的位点主要集中在增强子（enhancer）和CXXC4/5结合区域附近，这一点与它对DNA 5mC的氧化功能一致。而更广泛的DNA 5mC降低的位点，显著地富集在组蛋白 H2A 第 119 位赖氨酸单泛素化（H2AK119ub）的位置和H2AK119ub的去泛素化酶BAP1的染色质结合位点。BAP1是多聚梳抑制性去泛素化酶复合物（PR-DUB）中的主要成分，其还包括ASXL1-3，KDM1B和MBD5/6这些别的蛋白组分。其中MBD5/6都具备甲基化CpG结合域（MBD），但是它们并不和DNA结合。作者们发现MBD5/6都能和RNA结合，并且在细胞外和细胞中都能够富集含有m5C的RNA。Mbd6敲低可以导致m5C修饰的caRNA附近的染色质H2AK119ub水平提高，染色质可及性降低，和caRNA表达量降低。而这些染色质上的变化和Tet2 KO导致的结果有着很好的负相关。因此，MBD6通过结合caRNA上的m5C来促进组蛋白H2AK119ub去泛素化并且打开染色质。而这个RNA m5C-MBD6-H2AK119ub调控通路是对TET2缺失进行响应的主要分子机制。TET2缺失导致的小鼠造血祖细胞/干细胞（hematopoietic progenitor and stem cells, HSPCs）异常自我更新和偏倚分化是导致白血病发生的主要机制。作者们发现在HSPC中进行Mbd6敲低可以逆转Tet2 KO导致的基因表达变化。在表型上来看，Mbd6敲低，反义寡核苷酸（antisense oligo, ASO）对IAP的封闭，或者dCas13对IAP的选择性氧化都能够逆转Tet2 KO导致的HSPC自我更新和偏倚分化等缺陷。作者们还设计了一个在小鼠模型中的实验，将野生型（wild-type）或者Tet2 KO的HSPCs移植到受体小鼠中，只有Tet2 KO的HSPC会进行扩增，并且导致受体小鼠的脾脏异常增大。而Mbd6敲低可以完全逆转HSPC在受体中的扩增，甚至可以让受体小鼠的脾脏恢复到完全正常水平。在这些实验中，Mbd6敲低始终对野生型HSPCs没有明显影响。因此，TET2-caRNA m5C-MBD6-H2AK119ub通路对于HSPC的染色质状态调控是一个主要的影响白血病发生的机制，对Mbd6进行敲低可以几乎完全将Tet2 KO的HSPC分化和自我更新回复到正常水平。作者进一步对白血病细胞进行了研究。在一系列白血病细胞中，在TET2突变的SKM-1细胞中对MBD6的敲低导致了最明显的生长抑制。作者们进一步构建了TET2 KO的K-562（慢性髓性白血病）和THP-1（急性单核细胞白血病）模型，并且在体外和小鼠模型中分别验证了MBD6敲低能够对TET2 KO细胞造成更明显的生长抑制。同样的，在白血病细胞系中，TET2缺失会导致caRNA中逆转座子表达变高，此效果同样会被MBD6敲低逆转。总之，本研究发现了TET2 通过反转录转座子 RNA m5C 氧化调控染色质状态的新机制，并确定了下游的 MBD6 蛋白作为开发针对 TET2 突变恶性肿瘤的特异性疗法的可行靶点。这个分子机制强调了caRNA在染色体状态调控中的重要性。MBD6敲低在野生型细胞中经常导致较为不明显的作用，而只在TET2缺失细胞中可以逆转它导致的染色质状态变化，因此，MBD6是一个可以广泛地拮抗TET2缺失导致的缺陷的药物靶点。TET家族蛋白的经典功能是对DNA胞嘧啶五位甲基化基团的氧化以及由此引发的去甲基化。既往研究表明这些生物学过程在维持造血系统稳态中极为重要。在成年白血病中，TET2突变的检出率在10 ~ 60%，属于驱动细胞恶性转化的早期事件。TET2缺失以后，血液细胞染色质开放程度增加，异染色质区域甲基化降低，基因组稳定性下降并伴随突变率升高，这些改变增加了细胞发生恶性转化的风险。然而，TET2缺失导致低甲基化和染色质可及性升高的机制一直不是很清楚，并且这种现象相悖于TET抵御甲基化的作用。过去十多年大量的研究专注于DNA修饰在血液中的作用，近年也出现了不少从RNA m5C出发的研究，包括TET2通过氧化特定mRNA的m5C促进感染后的髓系造血，以及维持造血干细胞的归巢和适度的自我更新能力等发现。何川和徐明江团队的最新成果揭示TET2可以通过氧化与染色质结合的RNA的m5C来维持染色质致密性和逆转座子LTR元件的沉默。当小鼠胚胎干细胞缺失TET2时，逆转座子RNA的m5C得以保留，进而被Methyl-CpG-Binding-Domain Protein MBD6识别，招募PR-DUB去泛素化复合物对LTR区域去泛素化，提高了染色质开放度并激活LTR转录。这个调控机制在血液细胞中也具有保守性，通过构建小鼠和细胞模型，该工作进一步证明抑制MBD6这个效应因子可以显著逆转TET2缺失诱发的白血病进展。这项工作为一直难以解释的TET2缺失细胞呈现基因组低甲基化和染色质开放的现象提供了新颖的分子机制，揭示了TET2在多个维度上发挥着维持造血系统稳定性的作用，并为研发治疗TET2突变的白血病开辟了全新的赛道。这些发现从理论上阐明了TET2针对RNA的非经典酶活的缺失也与白血病的发生发展相关，拓展了人们对核酸双加氧酶的认知。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07969-x
制版人：十一
1. Delhommeau, F. et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. N. Engl. J. Med. 360, 2289–2301 (2009).2. Figueroa, M. E. et al. Leukemic IDH1 and IDH2 mutations result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and impair hematopoietic differentiation. Cancer Cell 18, 553–567 (2010).3. Ko, M. et al. Modulation of TET2 expression and 5-methylcytosine oxidation by the CXXC domain protein IDAX. Nature 497, 122–126 (2013).4. Guallar, D. et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nat. Genet. 50, 443–451 (2018).5. Fu, L. et al. Tet-mediated formation of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. J. Am. Chem. Soc. 136, 11582–11585 (2014).6. Liu, J. et al. N 6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription. Science 367, 580–586 (2020).7. Xu, W. et al. METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells. Nature 591, 317–321 (2021).8. Liu, J. et al. The RNA m6A reader YTHDC1 silences retrotransposons and guards ES cell identity. Nature 591, 322–326 (2021).9. Wei, J. et al. FTO mediates LINE1 m6A demethylation and chromatin regulation in mESCs and mouse development. Science 376, 968-973 (2022).
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