酒是伴随人类最久的加工饮品之一，主要由植物发酵制成。饮酒文化与人类共同发展，被广泛用于社交活动、饮食、食物保存和烹饪过程等。一般来说，饮酒以后会产生抑制中枢神经系统的作用，并随着喝酒量的增加，机体会产生，愉悦、放松或步态紊乱等行为。但是，不健康的饮酒行为包括从难以自控的暴饮到酒精成瘾不仅能造成不良的个人健康和安全问题还会带来严重的经济与社会问题【1,2】。据统计，全世界每年有近三亿人有这样的酒精使用障碍症状 (alcohol use disorder, AUD)。然而，当前对酒精使用障碍的形成机制所知有限，另外也缺乏有效的治疗方案与药物。另据世界卫生组织报道，截止2019年为止，全世界每年约有260万人死于饮酒，其中男性200万人，女性60万人。在中国，据统计人均酒精使用量从2005年的4.1升增加到2016年的7.2升，增幅有76%之巨【1】。这说明与酒精相关的健康与社会问题在中国有变严重的趋势。在生理水平上，已有研究表明酒精能通过调节多种离子通道和受体的活性来调控大脑中的抑制性神经元和兴奋性神经元的激活，进而影响行为。另外，也有研究显示酒精可以调节多巴胺的释放，引起饮酒后的愉悦感【2-4】。然而，尽管过去几十年已经取得很多进展，目前关于酒精如何在分子水平上靶向大脑神经元进而来调节饮酒相关的行为的机制仍不清楚。
近年来，美国国立卫生研究院国家神经疾病与中风研究所（NINDS）陆伟课题组一直在研究谷氨酸能兴奋性和g-氨基丁酸（GABA）能抑制性神经元的生理功能。课题组前期发现，膜蛋白 GSG1L 负向调节 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPA受体）介导的突触传递，比如GSG1L 的过表达会抑制 AMPA受体介导的突触传递，反之则会增强 AMPA受体介导的突触传递【5】。另外，在小鼠愿意付出更多的努力来获得更好的食物这一行为的研究中，课题组发现谷氨酸能传递到多巴胺能神经元的突触传递在奖赏动机行为中起到关键作用【6】。在课题组主要研究方向，也就是研究抑制能突触的发育与功能方面，该团队首先证实了N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA受体）在GABA 能突触的发育中起到关键的作用，并进一步阐述了抑制性突触蛋白Neuroligin 2 和 Slitrk3 如何在分子水平上相互作用调节GABA能突触的发育，并进而提出了GABA 能突触发育的基本理论框架【7】。该课题组在最近的工作发现了慢性压力能增强Src激酶的活性以及钙调蛋白的酪氨酸磷酸化，进而削弱了MyosinVa（MyoVa）与Neuroligin2（NL2）的相互作用，导致抑制性突触传递的减少并引发更强的焦虑样行为【8】。在GABAA受体研究方面，其实验室发现GABAA受体的第一个能调控受体的动力学和药理学的辅助亚基，也就是单跨膜蛋白Shisa79。实验室随后的一系列的工作表明Shisa7是能控制苯二氮卓类药物作用于GABAA受体并调节其降焦虑和麻醉效应的关键亚基【9】。另外，Shisa7还能调控tonic抑制电流，加快GABAA受体的关闭并降低受体单通道激活的频率【10-12】。
2024年10月1日, Cell杂志在线发表陆伟课题组的最新研究论文, 题为“The TMEM132B-GABAA receptor complex controls alcohol actions in the brain” ( TMEM132B-GABAA 受体复合物调控酒精在大脑中的作用)的研究论文。该研究发现一个新的单跨膜蛋白TMEM132B，其能结合GABAA受体并增强酒精对GABAA受体的正变构效应，进而调节和酒精相关的行为。这项研究进一步丰富了该团队对于GABAA受体的系列开创性研究，为酒精行为效应的分子机制提供了新的视角，并为临床治疗酒精成瘾以及新药研发提供了可能的理论指导。
探寻大脑中与酗酒相关的蛋白
酒精在动物身上能引起很多行为反应，但其分子机制并不清楚。以前的研究发现酒精能结合大脑中的很多膜蛋白，包括多种离子通道和受体（这其中也包括GABAA受体），并改变它们的活性，进而改变神经元活性并引起行为变化。但在分子细胞和系统行为水平上，具体的酒精靶点在和酒精相关的行为中的具体作用还悬而未决。为了研究这些问题，作者从长期酗酒患者的大脑组织入手，来研究膜蛋白的表达水平是如何在酗酒患者的大脑中变化的。理解这些分子水平上的变化有可能能为酒精为什么能在动物身上引起多种行为反应的分子机制提供一些答案。因此，作者首先从NIH的人类脑库获得6个正常人和6个酗酒者的大脑海马组织，并通过对人类大脑海马膜蛋白进行分离纯化和定量质谱学分析，找到一系列在表达水平上有变化的膜蛋白。进一步分析发现，新的跨膜蛋白TMEM132B在长期酗酒患者的海马中表达明显减低。通过构建GST-TMEM132B融合蛋白进行GST-Pulldown在小鼠海马匀浆液中反向寻找其结合蛋白，并通过质谱学分析发现其能够结合GABAA受体亚基系列家族成员。研究人员进一步在小鼠脑组织中进行免疫共沉淀实验中发现TMEM32B能够与GABAA受体结合。另外，在小鼠中遗传敲除TMEM132B会导致GABAA受体在突触后膜表达量下降并降低GABA能抑制性突触传递。这些结果表明TMEM132B蛋白与GABAA受体相互作用并调节GABAA受体在突触上的含量。TMEM132B调节酒精在GABAA受体上的正向变构效应
在此之前有许多研究已经显示酒精是GABAA受体的正向变构调节剂【2,13-15】。因此，作者研究了TMEM132B是否能调节酒精在GABAA受体上的作用。研究团队首先在表达GABAA受体和TMEM132B的HEK293T细胞中测量了GABA诱导的全细胞电流，发现虽然酒精（50 mM）在只表达GABAA受体的细胞中增强了非饱和浓度GABA（10 uM）诱导的全细胞电流，但在表达GABAA受体和TMEM132B的细胞中，全细胞电流的增强幅度更大。该结果表明TMEM132B能增强异源细胞中酒精对GABAA受体的正向变构效应。值得注意的是GABAA受体的其他结合蛋白，包括Shisa7、gephyrin、LHFPL4和Neuroligin2，并没有增强酒精对GABAA受体的正向变构效应，这表明TMEM132B在调节酒精对GABAA受体的正向变构效应方面具有独特性。另外，在HEK293T细胞中的剂量-反应曲线实验显示，TMEM132B显著增强了酒精在不同浓度下对GABAA受体的正向变构效应。然而，TMEM132B并没有改变酒精对调节GABA诱导电流的EC50。因此，TMEM132B增加了酒精增强GABAA受体电流的功效，但不改变其效力。另外，在澳大利亚昆士兰大学Angelo Keramidas研究员和陆伟实验室博士后彭世笑的共同协助下，研究人员进一步证明了TMEM132B结合GABAA受体以后能引起GABAA受体离子通道的关闭减慢。这一结果表明TMEM132B结合GABAA受体除了能增强酒精在GABAA受体上的正向变构效应，也能调控GABAA受体离子通道的动力学。基因敲除TMEM132B导致小鼠饮酒增多并降低酒精的镇定与催眠效应
接下来，研究人员对TMEM132B基因敲除小鼠进行系列的和酒精相关的行为学分析。在十字迷宫实验中，当给小鼠注射低剂量酒精（1.5g/kg）时，相比野生型小鼠，敲除TMEM132B的小鼠在十字架开放区活动次数明显减少。这说明基因敲除TMEM132B能降低低剂量酒精的抗焦虑效应。当注射高剂量的酒精（4g/kg）时，研究人员发现敲除TMEM132B的小鼠更不容易进入镇定与催眠的状态。比如，在翻正反射丧失（loss of righting reflex, LORR）实验中，对比野生型小鼠，TMEM132B敲除小鼠在注射等剂量的酒精（4g/kg）后，其达到失去知觉状态时所需的时间更久，另外从失去知觉中苏醒过来所用时间更短。这些结果表明，敲除TMEM132B以后会减弱酒精在神经系统中的作用，降低酒精的镇定和催眠的功效。另外，研究人员也设计了长期饮酒和酗酒实验，并观察到敲除TMEM132B的小鼠在训练饮酒一周左右，饮酒量明显增加，超过了同窝野生型对照小鼠。最后，研究人员在小鼠酗酒实验中发现敲除TMEM132B的小鼠有更严重的酗酒行为。 目前，虽然酒精能结合并调控大脑中多种离子通道和受体，但科学界对酒精是怎么引起各种行为反应的分子机制的了解并不深入。当前的研究结果表明，一个新的跨膜蛋白TMEM132B能调节酒精在GABAA受体上的功能，并能抑制小鼠的饮酒行为和增强酒精的降焦虑，镇定和催眠功能。当然，这项研究也不排除谷氨酸NMDA受体或其它受体和离子通道在调节酒精的行为效应上的重要功能。另外，酒精的行为效应也与多巴胺神经元的活性有关，但是酒精如何调控多巴胺神经元释放多巴胺还需要深入研究。1 Organization., W. H. Global status report on alcohol and health 2018 (WHO, 2018). (2018).2 Abrahao, K. P., Salinas, A. G. & Lovinger, D. M. Alcohol and the Brain: Neuronal Molecular Targets, Synapses, and Circuits. Neuron 96, 1223-1238, doi:10.1016/j.neuron.2017.10.032 (2017).3 MacKillop, J. et al. Hazardous drinking and alcohol use disorders. Nat Rev Dis Primers 8, 80, doi:10.1038/s41572-022-00406-1 (2022).4 Trudell, J. R., Messing, R. O., Mayfield, J. & Harris, R. A. Alcohol dependence: molecular and behavioral evidence. Trends Pharmacol Sci 35, 317-323, doi:10.1016/j.tips.2014.04.009 (2014).5 Gu, X. et al. GSG1L suppresses AMPA receptor-mediated synaptic transmission and uniquely modulates AMPA receptor kinetics in hippocampal neurons. Nat Commun 7, 10873, doi:10.1038/ncomms10873 (2016).6 Hutchison, M. A. et al. Genetic inhibition of neurotransmission reveals role of glutamatergic input to dopamine neurons in high-effort behavior. Mol Psychiatry 23, 1213-1225, doi:10.1038/mp.2017.7 (2018).7 Li, J. et al. Molecular Dissection of Neuroligin 2 and Slitrk3 Reveals an Essential Framework for GABAergic Synapse Development. Neuron 96, 808-826 e808, doi:10.1016/j.neuron.2017.10.003 (2017).8 Pandey, S. et al. Reversing anxiety by targeting a stress-responsive signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 121, e2400078121, doi:10.1073/pnas.2400078121 (2024).9 Han, W. et al. Shisa7 is a GABA(A) receptor auxiliary subunit controlling benzodiazepine actions. Science 366, 246-250, doi:10.1126/science.aax5719 (2019).10 Wu, K., Han, W., Tian, Q., Li, Y. & Lu, W. Activity- and sleep-dependent regulation of tonic inhibition by Shisa7. Cell Rep 34, 108899, doi:10.1016/j.celrep.2021.108899 (2021).11 Castellano, D., Wu, K., Keramidas, A. & Lu, W. Shisa7-Dependent Regulation of GABA(A) Receptor Single-Channel Gating Kinetics. J Neurosci 42, 8758-8766, doi:10.1523/JNEUROSCI.0510-22.2022 (2022).12 Wu, K. et al. Shisa7 phosphorylation regulates GABAergic transmission and neurodevelopmental behaviors. Neuropsychopharmacology 47, 2160-2170, doi:10.1038/s41386-022-01334-0 (2022).13 Sieghart, W. Allosteric modulation of GABAA receptors via multiple drug-binding sites. Adv Pharmacol 72, 53-96, doi:10.1016/bs.apha.2014.10.002 (2015).14 Olsen, R. W., Hanchar, H. J., Meera, P. & Wallner, M. GABAA receptor subtypes: the "one glass of wine" receptors. Alcohol 41, 201-209, doi:10.1016/j.alcohol.2007.04.006 (2007).15 Olsen, R. W. & Liang, J. Role of GABA(A) receptors in alcohol use disorders suggested by chronic intermittent ethanol (CIE) rodent model. Mol Brain 10, 45, doi:10.1186/s13041-017-0325-8 (2017).https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01024-9
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