肺炎球菌多糖结合疫苗菌株传代稳定性研究

目的 研究肺炎球菌多糖结合疫苗中各血清型肺炎球菌在液体培养基中传代培养的稳定性。

方法 在液体培养基中对各代次肺炎球菌的培养时长进行对比；对第15代次（P15）与P4（对照组）进行菌种检定与荚膜多糖抗原基因序列分析；将P15菌种按生产工艺进行发酵培养，分析培养情况和荚膜多糖抗原产量及质量，与P4代次对比。

结果 在P7—P15中，各代次培养时长相近，且P15菌种检定、抗原基因序列与P4相比无差异，序列相似度为100%；P15菌种发酵培养后，菌体生长、荚膜多糖产量与荚膜多糖相关检定指标与P4无明显差异，且均符合中国药典质量标准。

结论 用于生产肺炎球菌多糖结合疫苗的各血清型肺炎球菌在液体环境中传代培养稳定。

肺炎球菌广泛分布于自然环境、人类鼻咽与动物粪便中，已鉴定出超过100个血清型，少数可对人类致病，引起脑膜炎、菌血症、肺炎等，导致免疫力低下人群死亡。虽然抗生素治疗肺炎球菌感染的效果良好，但抗生素的不合理使用导致肺炎球菌耐多药菌株不断增加，使得预防显得尤为重要。当前有2类疫苗可用于预防肺炎球菌感染，即肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗。肺炎球菌多糖疫苗在婴幼儿、老年人和免疫缺陷者等人群中免疫应答低下。这种缺陷可以通过将多糖抗原与蛋白载体缀合来克服。另外，还有一些肺炎球菌蛋白以及灭活疫苗正处于上市申报或临床试验阶段。

随着肺炎球菌疫苗数量和种类的不断增加，中国药品监管部门对疫苗产量和质量的把控越来越严格。疫苗产量和质量的稳定性由菌种和工艺稳定性决定。据调研，目前尚无对肺炎球菌传代稳定性的报道。本研究采用更接近发酵环境的液体培养基对肺炎球菌进行传代培养，对其生物学特性、荚膜多糖产量与疫苗多糖质量等方面进行分析，从而确定肺炎球菌在液体环境中的传代稳定性。

肺炎球菌菌株来自中国医学细菌保藏管理中心，各血清型菌株号见表1。

1.2.1　试剂 固体菌种培养基与液体发酵培养基主要成分：大豆蛋白胨（25 kg/桶）购自法国Organotechnie公司， L -半胱氨酸盐酸盐（5 kg/袋，药用级）购自天津天药药业股份有限公司， L -色氨酸（100 g/瓶，生化试剂）购自国药集团化学试剂有限公司， L -酪氨酸（25 kg/桶， 药用级）购自天津天药药业股份有限公司，磷酸氢二钾（1 kg/袋，药用级）购自湖南九典宏阳制药有限公司，浓盐酸（500 ml/瓶，药用级）购自湖南尔康制药股份有限公司。葡萄糖发酵管、菊糖发酵管、棉子发酵管、蜜二糖生化管、山梨醇发酵管购自青岛海博生物技术有限公司，奥普托欣纸片购自温州市康泰生物科技有限公司。

1.2.2　菌种 肺炎球菌工作种子由北京民海生物科技有限公司自制，-70 ℃保存。

311二氧化碳培养箱、SORVAIL LYNX6000高速离心机购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，SP-752紫外分光光度计购自北京普希科技有限公司，VS-1300L-U洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，BLBIO-5GJ-4-H四联机械搅拌玻璃发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司，JMCDSPCONS超滤系统购自德国Merk Millipore公司。

将肺炎球菌工作种子第4代（P4）接种于固体菌种培养基上，为P5，培养一段时间后接种于液体发酵培养基中，为P6，此后在液体发酵培养基中连续传代培养至P15。菌浓度以694 nm处吸光度值（ A _{694 nm} ）表示，P6—P15均在液体发酵培养基中培养至 A _{694 nm} 达0.4~0.6时，对培养时长进行统计。

向P15菌液中加入体积分数30%的甘油，-70 ℃保存。对P15菌种与P4菌种（对照）进行菌种检定，检定项目包括培养特性、染色镜检、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、荚膜肿胀试验。

10 000× g 离心收集P15菌体，委托北京诺禾致源科技股份有限公司利用Oxford Nanopore测序技术进行第3代全基因组测序。使用DNAMAN软件对P15菌种与P4菌种（对照）的荚膜多糖合成相关的基因序列进行对比。

1.7.1　发酵研究 将24个血清型肺炎球菌根据进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类，分别选取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验对象。

分别开启肺炎球菌P15菌种与P4菌种（对照），经1代复苏后，分别转种于150 ml液体培养基中进行2代培养， A _{694 nm} 达0.4~0.6后分别转种至2.5 L发酵罐进行分批补料发酵培养。

1.7.2　多糖纯化 发酵培养结束后，加入0.1%脱氧胆酸钠杀菌；15 000× g 离心去菌体，上清液经超滤后进行酸沉（向超滤浓缩液中加入冰醋酸调pH至4.00±0.20，静置1~3 h）、醇沉（料液中加入无水乙醇静置3~24 h），再经10倍1 mmol/L醋酸钠缓冲液对离心后的上清液洗滤后得到精制多糖原液。根据中国药典2020年版三部（药典三部）通则3429免疫化学法速率散射比浊法测定多糖含量。分别对P15与P4（对照）菌种发酵液纯化后的多糖原液进行检测，参照药典三部相关方法，对多糖原液进行检测，包括固体总量、蛋白质含量（Lowry法）、核酸含量（分光光度法）、总氮（凯氏定氮法）、总磷（钼酸铵法）、分子大小〔琼脂糖凝胶（SepharoseCL-4B/SepharoseCL-2B）过滤法〕、氨基己糖（二氨基苯甲醛显色法）、甲基戊糖（半胱氨酸显色法）。

P6—P15各代菌种在液体发酵培养基中培养至相同的菌浓度（ A _{694 nm} 达0.4~0.6），培养时长见图1。P6菌种由固体培养转为液体培养，其生长环境发生了剧烈变化，因此部分P6菌种生长的时长大于其他代次。P7—P15各代次培养时长相近，在传代过程较稳定。

各血清型P15菌种检定结果均合格：培养特性试验结果均符合规定；染色镜检均为革兰阳性球菌；生化反应葡萄糖、菊糖、棉子糖、蜜二糖均为阳性，山梨醇为阴性；胆汁溶菌试验菌液均变透明；奥普托欣试验除33F血清型对照试验抑菌圈直径为16 mm外，其余试纸抑菌圈直径均为15 mm；荚膜肿胀试验菌体周围均可见明显无色荚膜。结果表明在液体环境中传代对肺炎球菌无影响。

荚膜多糖相关基因位点位于 dexB 和 aliA 之间，关键序列长约20 000 bp。对各血清型P15、P4 菌种的荚膜多糖相关基因序列进行对比，相似度均为100%。表明肺炎球菌在液体培养基环境中传代稳定。

分别将P15、P4（对照）菌种复苏后，用相同的发酵培养基与发酵条件进行发酵，并观察与对比同一血清型的2条发酵生长曲线，见图2。3、5、9N、17F、33F型肺炎球菌在发酵的迟缓期、对数生长期和稳定前期均无明显差异。当发酵进入对数后期或稳定前期时进行收获，收获时间点如图中标示的点所示。P15菌种收获时菌浓度与对照无明显差异。

分别对P15与P4（对照）的发酵液进行多糖含量检测，并对其发酵的多糖表达量进行计算，见表2。3、5、9N、17F、33F型P15菌种发酵表达量与P4（对照）无明显差异。

由表3可知，3、5、9N、17F、33F型P15与P4（对照）的多糖原液各项指标无明显差异，且均符合药典三部23价肺炎球菌多糖疫苗标准。

将24个血清型肺炎球菌根据进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类。第1类包括1、2、6A、6B、7F、17F、18C、19A、19F、22F和23F；第2类包括8、9N、9V、11A、14和15B；第3类包括10A、20和33F；第4类包括4、5和12F；第5类包括3型。本研究分别选取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验研究对象。

肺炎球菌传代培养时，P6菌种由固体培养转为液体培养，其生长环境发生了剧烈变化，且由于不同血清型适应能力不同，因此部分P6菌种生长的时长大于其他代次。不同血清型在P7—P15各个代次中，培养至相同菌浓度（ A _{694 nm} 在0.4~0.6）时，其培养时长在传代过程中都较为稳定。在检测方面，根据药典三部通则规定的形态及培养特性、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、血清凝集试验及遗传稳定性研究等方法，分别对P15与P4（对照）菌种进行检定。药典三部中规定主种子批启开后至工作种子批，传代应不超过5代；工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过5代。通过上述实验和检测结果，可以得出结论：各血清型肺炎球菌菌种在生物学特性、生化特性、血清凝集试验和分子遗传特性等方面均符合23价肺炎球菌多糖疫苗各论要求，从而证实了肺炎球菌在使用代次内传代过程中能够稳定遗传。

在遗传稳定性方面，对肺炎球菌1个代次菌种经培养收获的菌体进行了全基因组测序，并对肺炎球菌荚膜多糖合成的靶位点基因序列进行对比，相似度均为100%。使用3代测序技术对肺炎球菌荚膜多糖关键基因片段进行检测，P4与P15测序中暂未发现序列突变，通过比较不同传代水平菌种基因组的核苷酸序列确定了种子批的遗传稳定性。通过对基因组的测序结果分析可以在后续的生产和使用过程中更好地保存、管理、监测菌种。

通过控制单一变量的方法，分别将P15与P4代次复苏后的3、5、9N、17F、33F型菌种进行发酵培养，同一血清型发酵生长曲线的迟缓期、对数生长期和稳定期均无明显差异，且P15与P4菌种的发酵表达量无明显差异，均在800 μg/ml以上，从而证实了肺炎球菌在使用代次内的传代过程中具有良好的遗传稳定性。