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全细胞生物催化剂（WCB）具有独特的优势，已广泛用于精细化学品和大宗化学品以及药物活性成分的高效生物合成。越来越多的研究者合理设计WCB，将异源酶或合成途径的基因引入到微生物宿主（例如大肠杆菌），利用廉价底物生成高价值的产品。在异源宿主中构建生物合成途径的技术在综述文章
“New tools for reconstruction and heterologous expression of natural product biosynthetic gene clusters”
中进行了广泛的讨论，包括快速多基因整合方法、基因编辑方法学以及组合酶表达技术等。目前，直接用于构建大于5个异源基因的代谢途径的策略暂未完全开发。因此，生物合成途径规划以及酶筛选和工程化至关重要。
同时，需要通过代谢工程策略改进WCB生物合成途径降本增效，包括确定限速步骤，避开或者缓解限速步骤；平衡途径以消除有毒中间体或副产物的积累；缩短途径，减弱中间体的反馈抑制；最大化途径的产物通量：例如，阻断竞争途径、增强前体和辅助底物的供应以及改善辅因子的平衡等。
近日，
中科院微生物所/北京工商大学研究团队
设计并优化了一种新的生物合成途径，以廉价的丁香酚为底物，高效生成香料成分香兰素。使用丁香酚的阿魏酸生物合成途径已报道，然而由于中间物质松柏醛抑制了香草酰辅酶A合成酶（Fcs）的活性，将其直接与使用阿魏酸作为底物的下游香兰素生物合成结合起来不可行。因此，作为概念验证，团队设计了香兰素生产的阿魏酰辅酶A生物合成途径，引入肉桂酰辅酶A还原酶（CCR），催化松柏醛转化为阿魏酰辅酶A，克服固有的抑制并简化合成过程（图1）。目前，这项研究成果已经以
“Artificial Biosynthetic Pathway for Efficient Synthesis of Vanillin, a Feruloyl-CoA-Derived Natural Product from Eugenol”
为题发表在
Journal of Agricultural and Food Chemistry
上。
图1 阿魏酸生物合成途径（蓝色箭头）、香兰素生物合成途径（橙色箭头）以及新设计的以丁香酚为底物的香兰素生物合成途径（绿色背景所示）。
该过程涉及绕过限速步骤、缩短生物合成路线、增强原子经济性、减少辅因子依赖性以及防止有毒中间体的积累。通过引入CCR酶来克服了松柏醛对Fcs的抑制，对CCR酶进行了定向进化，改变了辅因子特异性，使香兰素的产量得到了显著提高。同时，对宿主菌进行基因敲除：通过敲除宿主菌内源性醛还原酶，减少了香兰素还原为
香草醇
的损失，提高了香兰素产量。最后，通过优化以下条件进一步提高香兰素产量：
（1）通过优化IPTG诱导剂浓度，提高了VaoA和
Ech
的表达水平，进而提高了香兰素产量。
（2）底物溶解溶剂：通过比较不同溶剂，发现
DMSO
更适合溶解丁香酚，从而提高了香兰素产量。
（3）底物投加方式：通过分批投加丁香酚，避免了高浓度丁香酚的毒性影响，提高了香兰素产量。
（4）Ech表达优化：通过在Ech基因后插入稀有密码子，找到了最适合的Ech表达量，使香兰素产量最大化。
总而言之，该研究为高效利用丁香酚生物合成香兰素提供了一种新的策略。
此外，构建全细胞生物催化剂，反馈抑制是常见的问题。前日，中国海洋大学研究团队通过工程化且过表达反馈抑制耐受酶克服反馈抑制（图2），即对受到反馈抑制的酶进行改造以适应高浓度的底物、产物或者中间体。该研究通过逐步代谢工程改造毛霉菌株A1145,实现了环二苯丙氨酸（
cFF
）的高效生产。首先，从海洋真菌Penicillium janthinellum中异源表达了NRPS基因penP1，在A1145中获得初步的cFF生产能力。然后，通过敲除竞争途径关键基因、过表达反馈抑制耐受酶和引入途径增强前体供给等策略，系统地优化了A1145的苯丙氨酸途径和 shikimate 途径，最终实现了cFF产量的显著提升。
图2 解除关键酶的反馈抑制来提高环二苯丙氨酸产量的策略。
通过设计并引入生物合成途径，构建全细胞生物催化剂，高效生产高附加值的化学品的生物催化备受关注并迅速发展着，为未来部分替代传统的化学催化合成化学品的生产方式奠定基础。
1、 https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c08723
2、https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.02.009
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